融合多角體的家蠶膜蛋白BmCPH43的表達(dá)純化及結(jié)晶研究.pdf

1、為了探討膜蛋白的表達(dá)問題，本研究從本試驗(yàn)室家蠶膜蛋白庫中選取了BmCPH43蛋白，預(yù)測該蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)，N端有一個(gè)信號(hào)肽。由保藏菌株質(zhì)粒擴(kuò)增得到BmCPH43基因的ORF序列，該cDNA序列全長568bp，含有一個(gè)243bp的完整開放閱讀框(ORF:204---428bp)，編碼80個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測分子量為8.2kD，等電點(diǎn)為5.27。將BmCPH43基因片段前連接多角體片段并克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-32a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)

2、中，構(gòu)建了融合有多角體基因的重組pET-32a(+)載體，在多角體與BmCPH43之間引入了TEV蛋白酶切位點(diǎn)序列。經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實(shí)重組質(zhì)粒正確。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)(28℃)表達(dá)后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，與陰性對(duì)照相比在55kD(融合標(biāo)簽18kD)附近有一條特異性蛋白條帶，與預(yù)測值相符。
　　 重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，分別采用兩種不同的

3、方法進(jìn)行純化。一種通過多角體蛋白在堿性條件下溶解的特性，通過調(diào)節(jié)pH值的方法反復(fù)洗滌，對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)溶菌酶消化、離心和不同pH值的緩沖液洗滌即可得到純度在70％以上的重組蛋白的粗提物；另一種是利用親和層析的方法純化重組蛋白，通過尿素溶解包涵體，溶解上清通過NI親和柱純化重組蛋白。將純化后的重組蛋白進(jìn)行AcTEV酶切消化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，相比陰性對(duì)照，酶切樣品多出兩個(gè)條帶，其大小分別對(duì)應(yīng)BmCPH43和融合有pET-32

4、a(+)載體標(biāo)簽的多角體蛋白的大小。
　　 通過調(diào)節(jié)pH值純化重組蛋白，以懸滴法點(diǎn)結(jié)晶，置于16℃結(jié)晶室培養(yǎng)。通過對(duì)結(jié)晶條件的摸索，確定在蛋白含量lmg/ml容易形成結(jié)晶，獲得了融合有多角體的膜蛋白的結(jié)晶。
　　 真核表達(dá)通過家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-Bac系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，通過SDS-PAGE及Western Blotting分析證明，融合蛋白Ph-BmCPH43已成功表達(dá)。RNAi、MTT檢測結(jié)果表明BmCPH4