RNA干擾VEGF-C基因治療膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:觀察VEGF-C基因下調(diào)后膀胱癌細(xì)胞株增殖和侵襲能力的改變,體外驗(yàn)證VEGF-C基因做為治療靶點(diǎn)的可行性;應(yīng)用膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞建立膀胱癌的裸鼠移植瘤模型,并觀察重組質(zhì)粒CRM-30-shVEGF-C對(duì)裸鼠移植瘤組織內(nèi)VEGF-C表達(dá)的影響及對(duì)腫瘤的生長抑制作用,為其臨床開發(fā)應(yīng)用和探索腫瘤治療的新途徑提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ);篩選與VEGF-C相互作用的基因及可能的信號(hào)通路,探討VEGF-C基因在膀胱癌中的作用機(jī)制。 方法:

2、1、構(gòu)建II型啟動(dòng)子啟動(dòng)的新型microshRNA結(jié)構(gòu)的干擾質(zhì)粒CRM-30-shVEGF-C,對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T24和膀胱鱗癌細(xì)胞株ScaBER進(jìn)行轉(zhuǎn)染并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,應(yīng)用RT-PCR、Western-blot、ELISA、細(xì)胞免疫組化等方法研究干擾后細(xì)胞株VEGF-C表達(dá)水平的變化,應(yīng)用MTT及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,用流式細(xì)胞技術(shù)研究其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響,應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)和黏附實(shí)驗(yàn)

3、驗(yàn)證其轉(zhuǎn)移侵襲能力的改變。 2、①以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞株與T24細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠皮下接種,進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn);②以瘤塊皮下接種法建立裸鼠皮下膀胱腫瘤模型,成瘤后,分為四組,瘤內(nèi)分次多點(diǎn)注射Lipofectmin2000介導(dǎo)的CRM-30-shVEGF-C質(zhì)粒、CRM-30-non、PCDNA3.1/VEGF-C質(zhì)粒和單純的DMEM,研究VEGF-C對(duì)膀胱腫瘤的作用。治療過程中測(cè)量腫瘤體積,計(jì)算腫瘤抑制率,并觀察各組治療后腫瘤生長情況,

4、并繪制腫瘤生長曲線;應(yīng)用RT-PCR及Westernblot、免疫組化方法觀察VEGF-C在mRNA及蛋白質(zhì)水平表達(dá)的情況。 3、利用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)分析T24細(xì)胞VEGF-C基因下調(diào)后全基因組表達(dá)譜的變化,篩選與VEGF-C相互作用的差異基因及信號(hào)通路。 結(jié)果:1、干擾質(zhì)粒對(duì)T24、ScaBER細(xì)胞均有較高的轉(zhuǎn)染效率,在mRNA及蛋白水平均能顯著降低VEGF-C的表達(dá);干擾后,S期細(xì)胞的百分率降低,G1期的百分率升高

5、,凋亡細(xì)胞比例明顯增加;干擾質(zhì)粒能顯著抑制細(xì)胞增殖;干擾后,細(xì)胞的透膜率和黏附率明顯降低。 2、①CRM-30-shVEGF-C質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞成瘤能力下降了60%②成功用細(xì)胞接種法和瘤塊接種法構(gòu)建了裸鼠人膀胱癌T24細(xì)胞株的動(dòng)物模型,T24細(xì)胞成瘤率為88%(22/24)。③VEGF-C表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.1/VEGF-C能促進(jìn)腫瘤的生長;VEGF-C干擾質(zhì)粒CRM-30-shvEGF-C能抑制腫瘤的生長,并能延緩或

6、抑制腫瘤壞死出血的發(fā)生和荷瘤裸鼠惡液質(zhì)的出現(xiàn)。④RT-PCR和WesternBlot結(jié)果表明與DMEM對(duì)照組相比,PCDNA3.1/VEGF-C可顯著增高瘤體中VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表達(dá);CRM-30-shVEGF-C質(zhì)粒可顯著降低瘤體中VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。 3、篩選出了1298個(gè)共同差異表達(dá)的基因,這些基因涉及到細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化等多個(gè)方面。VEGF-C基因下調(diào)后,

7、趨化因子家族基因CXCL3、IL8、CCL20、CXCL6、CXCL1、CXCL5、CXCL2下調(diào),趨化因子受體CCR7上調(diào),黏附因子家族中CD44、ITGB1、ITGA2下調(diào),ITGA4、ITGB3、ITGB4、ICAM2上調(diào)。VEGF-C的下調(diào)也與Gadd45a的下調(diào)有關(guān)。 結(jié)論:1、在細(xì)胞水平上證實(shí)VEGF-C基因可以作為膀胱癌基因治療的有效靶點(diǎn),為后續(xù)的以VEGF-C為靶點(diǎn)的膀胱癌基因治療體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2、

8、VEGF-C高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤生長,使腫瘤出現(xiàn)壞死和出血,荷瘤裸鼠出現(xiàn)惡液質(zhì);VEGF-C低表達(dá)則能抑制腫瘤細(xì)胞生長,延緩腫瘤出現(xiàn)壞死、出血以及惡液質(zhì)的出現(xiàn)。本研究從正反兩方面為以VEGF-C為靶點(diǎn)的腫瘤基因沉默療法提供了可靠的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 3、在基因水平上證實(shí)了VEGF-C基因是影響細(xì)胞黏附和侵襲的重要因子,主要通過調(diào)控趨化因子家族基因和黏附因子家族基因而發(fā)揮作用,干擾VEGF-C后,膀胱癌通路中的許多基因均有明顯改變,進(jìn)一

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