Ad-IL-24-OSM雙基因腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 構(gòu)建攜帶白細(xì)胞介素24（Interleukin-24，IL-24）基因和抑瘤素M(OSM)基因的雙基因共表達(dá)腺病毒載體（Ad-IL-24-OSM）并開展對(duì)A375人黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 方法:
　　 在本科室已成功構(gòu)建pTrack-CMV-poly-A-promoter轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在多克隆酶切位點(diǎn)的BglⅡ、SalⅠ之間和NotⅠ、XhoⅠ之間分別插入IL-24和OS

2、M基因片段，構(gòu)建pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM重組轉(zhuǎn)移載體，經(jīng)同源重組、包裝和擴(kuò)增獲得Ad-IL-24-OSM雙基因共表達(dá)重組腺病毒子，體外檢測(cè)Ad-IL-24-OSM重組腺病毒子的效價(jià)，感染A375黑色素瘤細(xì)胞后，RT-PCR、westernblot法檢測(cè)IL-24、OSM在A375人黑色素瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá);熒光顯微鏡觀察感染后的A375細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;MTT法檢測(cè)Ad-IL-24-O

3、SM對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)重組病毒子對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞的周期生長(zhǎng)抑制和促凋亡效應(yīng);半定量RT-PCR法檢測(cè)A375黑色素瘤細(xì)胞中的p21、p53、Bax、Bcl-2mRNA的表達(dá)水平。westernblot檢測(cè)Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá);通過建立A375人黑色素瘤細(xì)胞移植瘤瘤動(dòng)物模型，用Ad-IL-24-OSM重組病毒子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，檢測(cè)瘤體重量，HE染色法檢測(cè)瘤塊組織切片中的細(xì)胞核

4、形態(tài)的變化;免疫組化檢測(cè)移植瘤塊切片中P21、P53、bax、bcl-2、CD34、COX2、Caspase-3的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.PCR和雙酶切分析結(jié)果顯示成功構(gòu)建了Ad-IL-24-OSM雙基因共表達(dá)腺病毒載體。
　　 2.RT-PCR和Westernblot檢測(cè)證實(shí)腺病毒介導(dǎo)的IL-24和OSM雙基因均可在A375人黑色素瘤細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。
　　 3.Ad-IL-24-OSM

5、雙基因共表達(dá)腺病毒載體能顯著抑制A375細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并顯著優(yōu)于Ad-IL-24、Ad-OSM單基因組(P＜0.05)。
　　 4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明Ad-IL-24-OSM腺病毒載體可以顯著抑制裸鼠人黑色素瘤移植瘤的生長(zhǎng)，且均具有抑瘤增效的相加作用(Q=1.02)。
　　 5.細(xì)胞凋亡分子機(jī)制檢測(cè)發(fā)現(xiàn):Ad-IL-24-OSM能明顯上調(diào)A375人黑色素瘤細(xì)胞P21、P53、Bax、Caspase-3和下調(diào)Cox-