目的基因過(guò)表達(dá)慢病毒顆粒感染人心肌成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：將KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因載入慢病毒顆粒，探討目的基因過(guò)表達(dá)慢病毒顆粒感染人心肌成纖維細(xì)胞使之重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)的關(guān)鍵技術(shù)。
　　 方法：采用直接貼壁法分離培養(yǎng)出人心肌成纖維細(xì)胞(Human cardiacfibroblasts，HCFs)，取孕13.5～14.5d昆明胎鼠，采用胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)出小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mo

2、use embryonic fibroblasts，MEFs)：分別在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以臺(tái)盼藍(lán)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞活力及鑒定。采用絲裂霉素-C(Mitomycin C，MMC)處理胚胎成纖維細(xì)胞制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。分別構(gòu)建和包裝含KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因過(guò)表達(dá)的慢病毒顆粒、含綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的慢病毒顆粒。將表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒顆粒感染人心

3、肌成纖維細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察感染效率及熒光表達(dá)情況，篩選最佳感染條件及感染復(fù)數(shù)(Multiplicity ofinfection，MOI值)；將含KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因過(guò)表達(dá)的慢病毒顆粒感染人心肌成纖維細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)變化，篩選最佳實(shí)驗(yàn)室條件。
　　 結(jié)果：采用組織塊直接貼壁法多次、同時(shí)貼壁多個(gè)組織塊可獲得足量的HCFs，其雜細(xì)胞少，活力佳，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)。選取孕13.5～1