WSSV膜蛋白VP26與核衣殼蛋白VP51相互作用位點的鑒定及低溫保存WSSV病毒粒子方法的建立.pdf

1、　　對蝦白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是一種桿狀型的環(huán)狀雙鏈DNA (dsDNA)病毒。由該病毒引起的對蝦大規(guī)模死亡已成為影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要制約因素。隨著研究的不斷深入,已對 WSSV 的結(jié)構(gòu)蛋白有了一定了解。本實驗主要包括WSSV膜蛋白VP26與核衣殼蛋白VP51相互作用位點的鑒定以及低溫保存WSSV方法的建立兩個方面：
　　(1)WSSV 膜蛋白VP26 核衣殼蛋白

2、VP51 之間存在著相互作用,從而將WSSV的囊膜與核衣殼聯(lián)系起來。為了進一步研究VP26與 VP51之間的相互作用,我們通過免疫共沉淀的方法確定了VP26與VP51相互作用的位點。在實驗過程中我們設計了一系列VP51突變體并將這些突變體克隆到載體pET28-V5上使VP51突變體融合表達V5標簽；同時還將設計的一系列VP26突變體克隆到載體pET-HIS上,使VP26突變體融合表達HIS標簽。然后分別將VP51突變體與VP26突變體在

3、E.coil BL21中共表達,再利用免疫共沉淀技術(shù)以及Western Blot進行檢測。
　　我們發(fā)現(xiàn)在VP26上和VP51發(fā)生相互作用的位點主要位于第156位至204位氨基酸而在VP51與VP26發(fā)生相互作用的位點位于第141位至180位氨基酸、第261位至350位氨基酸以及第431位至至466位氨基酸。通過對VP26的晶體結(jié)構(gòu)分析進一步推測VP26上與VP51發(fā)生相互作用的位點主要位于第174位至182 位氨基酸。通過對

4、 VP51 二級結(jié)構(gòu)以及親水性的預測分析發(fā)現(xiàn),VP51 上與VP26具有相互作用的區(qū)域主要是由α螺旋以及無規(guī)則卷曲組成。
　　(2)在實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)純化的完整病毒在 4℃下保存一段時間后開始出現(xiàn)一定程度降解并且不同時間提純的病毒懸液在感染力上有所差異,為了降低感染實驗過程中的誤差,我們嘗試利用低溫保存技術(shù)對 WSSV 病毒進行低溫凍存。在實驗過程中,我們先將不同濃度梯度(5%至20%)的DMSO或甘油作為保護劑加入到 W

5、SSV 提取液中,在-80℃凍存 15 天后,然后通過透射電鏡觀察凍存病毒粒子的形態(tài)。
　　結(jié)果顯示當使用 DMSO 做為凍存保護劑時電鏡下觀察到的完整病毒粒子數(shù) 量明顯比不含任何凍存保護劑的陰性對照組要多,其中以10%濃度為最佳條件；當使用甘油作為凍存保護劑時電鏡下只能觀察到幾個完整病毒,大部分病毒開始出現(xiàn)解聚并且甘油濃度的增加沒有起到有效的保護效果。然后我們利用透射電鏡觀察凍存15天和30天的含10%DMSO的病毒懸液發(fā)現(xiàn)