抗蓖麻毒素單克隆抗體6C2中和保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及機(jī)制.pdf

1、蓖麻毒素(Ricin)是存在于蓖麻籽油中的植物毒素。由A和B兩個(gè)亞基組成，并通過(guò)一條二硫鍵連接在一起。蓖麻毒素B亞基(RTB)是一種半乳糖特異性的凝集素，能夠結(jié)合細(xì)胞表面含糖脂或糖蛋白的受體。這些結(jié)合的毒素隨后通過(guò)宿主細(xì)胞依賴的內(nèi)化機(jī)制和從內(nèi)吞小體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆向運(yùn)輸機(jī)制被運(yùn)入細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)蓖麻毒素A鏈(RTA)轉(zhuǎn)移到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，它的糖苷酶活性位點(diǎn)能夠識(shí)別rRNA，阻礙蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的多肽延伸并導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因?yàn)槠渚哂懈咧滤篮鸵子讷@得的特

2、性，蓖麻毒素被認(rèn)為是一種可能被用于生化攻擊的生物戰(zhàn)劑。
　　 目前，盡管已經(jīng)發(fā)展出了多種針對(duì)蓖麻毒素的治療方法，但特異性的中和抗體治療蓖麻毒素中毒仍舊是一種最特異和最高效的治療方法。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多抗蓖麻毒素的中和保護(hù)性抗體，其中和保護(hù)作用的機(jī)制往往僅局限于對(duì)已知功能表位的阻斷性抑制的探討。對(duì)于中和保護(hù)性抗體發(fā)揮中和保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)則知之甚少。
　　 本研究篩選得到5株抗蓖麻毒素A鏈單克隆中和抗體，其中6C2在蛋

3、白質(zhì)合成抑制試驗(yàn)，vero細(xì)胞體外保護(hù)實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的中和保護(hù)活性。有趣的是我們經(jīng)抗原表位淘選，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合表位與已經(jīng)報(bào)道的酶催化活性位點(diǎn)相距甚遠(yuǎn)。
　　 為明確6C2中和抗體的結(jié)合表位以及中和保護(hù)機(jī)制。我們進(jìn)行了6C2 Fab-RTA的共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。在3.0埃水平上解析了中和抗體6C2 Fab和RTA復(fù)合物的共結(jié)晶的X射線衍射結(jié)構(gòu)。抗體6C2高變區(qū)上的H1、H2、H3和L1形成了一個(gè)“口袋”，與RTA上的α螺旋

4、相互作用。通過(guò)對(duì)RTA的點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，Q98，E99，E102，T105是抗體6C2與RTA結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。但SPR和pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗體6C2的結(jié)合僅能夠降低RTA與核糖體的親和力。
　　 我們進(jìn)一步對(duì)抗體結(jié)合前后RTA的結(jié)構(gòu)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，6C2和RTA的結(jié)合會(huì)影響R180和E177與底物之間的鍵角和成鍵距離。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，R180和E177正是RTA催化腺嘌呤切割的活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸。對(duì)6C2結(jié)合的α螺旋區(qū)域進(jìn)行柔

5、性分析，E99A、D100A，H106A、 L107A以及D96A三組氨基酸的點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，α螺旋的柔性和RTA的催化活性成正相關(guān)。由此可推測(cè)，6C2與RTA的結(jié)合，可能通過(guò)降低α螺旋的柔性從而抑制RTA的催化活性而發(fā)揮其中和保護(hù)作用。
　　 基于以上研究成果，我們認(rèn)為，6C2結(jié)合表位是一個(gè)全新的抗蓖麻毒素中和表位。6C2的中和保護(hù)作用是通過(guò)影響RTA與核糖體的結(jié)合，同時(shí)改變RTA柔性抑制蓖麻毒素催化活性兩種途徑協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。本