家蠶核型多角體病毒（BmNPV）lef-7基因及魚傳染性胰壞死病病毒（IPNV）VP2基因的分子生物學(xué)研究.pdf

1、本論文對家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovims，BmNPV)的某些功能基因進(jìn)行了更為深入的研究。首先確定了BmNPVlef-7基因精確的翻譯和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，對gp64基因進(jìn)行了表達(dá)和抗體制備，構(gòu)建了缺失chiA的BmNPVBactoBac表達(dá)系統(tǒng)并對外源基因進(jìn)行了表達(dá)。同時(shí)，對傳染性胰壞死病病毒(IPNV)的重要功能基因VP2進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下： 1.BmNPVlef-7基因轉(zhuǎn)錄和翻

2、譯起始位點(diǎn)的鑒定 BmNPVlef-7基因與病毒DNA復(fù)制及晚期、極晚期基因的表達(dá)有關(guān)。序列分析表明，BmNPVlef-7基因編碼區(qū)的5’端比苜蓿丫蚊夜蛾核型多角體病毒(AutographaCalifornianuclearpolyhedrosisvires，AcNPV>的lef-7基因多出45bp核苷酸序列，然后一直到終止密碼子共有42個堿基缺失。在推斷的，lef-7基因起始密碼子下游46bp處還有一個ATG密碼子，并且這兩個

3、ATG密碼子處于同一個開放閱讀框內(nèi)。為了明確BmNPV，lef-7基因的翻譯起始位點(diǎn)是否與AcNPV有所不同，我們對BmNPVlef-7基因的翻譯和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定。首先克隆了從BmNPV，lef-7基因第二個ATG密碼子開始的lef7基因片段，并在大腸桿菌中與GST進(jìn)行了融合表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物純化后免疫家兔制備了其多克隆抗體。同時(shí)構(gòu)建了缺失其5’端第一個翻譯起始密碼子ATG開始的¨bp核苷酸序列的BmNPV重組病毒Bmlef7M1

4、一。用制備的抗體LEF-7抗體對BmNPV和Bmlef7M1一感染的家蠶細(xì)胞進(jìn)行Westernblot分析表明二者都能產(chǎn)生一26kDa的特異性條帶，與預(yù)計(jì)的LEF-7大小相符。共聚焦顯微分析表明，LEF-7在BmNPV和BmlefTMl一感染的細(xì)胞中均位于細(xì)胞核內(nèi)。以上結(jié)果表明lef-7基因假定的翻譯起始密碼子ATG(位于BmNPV基因組97059nt)對于，lef-7基因的表達(dá)可能是非必需的。5'-RACE分析表明，BmNPV和Bml

5、ef7M1一感染細(xì)胞中l(wèi)ef-7mRNA都是從位于第二個ATG密碼子(位于BmNPV基因組97014nt)上游26bp、假定的翻譯起始密碼子ATG上游20bp處的ATCATTmotif開始轉(zhuǎn)錄。 2.BmNPVgp64基因的表達(dá) PCR擴(kuò)增出1593bp的gp64基因，并分別克隆至原核表達(dá)載體pET28a和供體質(zhì)粒pFastBacHTa中，在大腸桿菌(Eschechiacoli)BL21和桿狀病毒BactoBac表達(dá)系統(tǒng)

6、中分別進(jìn)行了表達(dá)。gp64基因在大腸桿菌表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的10﹪，表達(dá)產(chǎn)物主要存在于包涵體中，將表達(dá)產(chǎn)物割膠回收后免疫家兔制備了高效價(jià)的多克隆抗體。用該抗體去檢測昆蟲細(xì)胞中g(shù)p64基因的表達(dá)產(chǎn)物野生BmNPV感染的家蠶細(xì)胞，均產(chǎn)生與預(yù)期大小相符的特異性條帶，說明GP64抗體具有較好的特異性，為以后進(jìn)一步利用pull-down和免疫共沉淀(IP)技術(shù)從家蠶培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白中分離出與BmNPVGP64囊膜糖蛋白相互作用的蛋白提供了重要的研

7、究基礎(chǔ)。 3.缺失幾丁質(zhì)酶基因的BmNPV-Bacmid的構(gòu)建及外源基因的表達(dá) 將egfp基因、BmNPVchiA基因上游1550bp及下游1997bp的片段，依次克隆到pSK+載體中，構(gòu)建缺失chiA基因的轉(zhuǎn)移載體pEGFP△cMA。將轉(zhuǎn)移載體pEGFP△chMDNA和BmNPVBacmidDNA共轉(zhuǎn)染，經(jīng)過兩輪空斑篩選，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHl0B菌株，經(jīng)PCR鑒定得到了egfp基因取代了cMA基因的重組Bacmid，

8、其中chiA基因編碼區(qū)終止密碼子上游497bp的片段被保留。將輔助質(zhì)粒pMON7124轉(zhuǎn)入含重組Bacmid的DHlOB菌株中，得到了能進(jìn)行外源基因表達(dá)的缺失chM基因的Bact0Bac表達(dá)系統(tǒng)DHl0BmBac△cMA。在缺失和未缺失chM基因的BactoBac表達(dá)系統(tǒng)中對魚傳染性胰壞死病病毒(IPNV)VP2基因的抗原決定區(qū)VP2e分別進(jìn)行了表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示rBmBac-VP2e和rBmBac△chiA-VP2e感

9、染家蠶細(xì)胞后與對照相比均無明顯的特異表達(dá)條帶，但用抗VP2e多克隆抗體及6×His單克隆抗體對表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行Western-blot分析表明，在32kDa位置均出現(xiàn)一明顯條帶，比預(yù)期分子量約大了6kDa左右。證明VP2e在重組病毒rBmBac-VP2e和rBmBac△chiA-VP2e感染的細(xì)胞中均得到了表達(dá)，且表達(dá)量無明顯的差異。rBmBac-VP2e和rBmBac△ch／A-VP2e感染的蛹血淋巴均能產(chǎn)生一條約32kDa左右的條帶

10、，與細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物大小一致，且條帶沒有明顯的差異。 4.IPNVVP2抗原決定區(qū)(VP2e)研究 已知VP2是病毒衣殼蛋白的主要成分，為糖蛋白，中和抗體產(chǎn)生有關(guān)。IPNVAM-98和MABVY-6株系VP2氨基酸序列同源性為88﹪。VP2抗原決定區(qū)(VP2e)同源性為84﹪，共32個氨基酸殘基有差異，占所有差異殘基數(shù)的52﹪?？寺×薞P2抗原決定區(qū)645bp的VP2e片段，并在大腸桿菌中與GST進(jìn)行了融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分

11、子量為49kDa，SDS-PAGE檢測和薄層掃描表明，融合蛋白表達(dá)量約占大腸桿菌細(xì)胞總蛋白的25﹪，其中大約90﹪的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。IPNV~P2表達(dá)時(shí)相分析表明，感染后6h開始檢測到IPNVVP2的前體，同時(shí)可以檢測到少量成熟的VP2，在感染后12-24hVP2前體表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的推移直到感染后72h，VP2前體和成熟VP2的水平基本相當(dāng)。抗IPNVVP2e抗體和抗MABVVP2e抗體檢測到的兩種病毒感染細(xì)胞中的VP2

12、條帶基本一致。ELISA分析表明，抗IPNVVP2e抗體對IPNV的特異性比MABV高50﹪左右。兔抗IPNVVP2e抗體能檢測到IPNV的最低病毒滴度為9．8×103PFU/ml。檢測到的MABV滴度為6.31×105PFU/ml。血清中和實(shí)驗(yàn)表明制備的VP2e抗血清能明顯中和IPNV病毒的感染，在10-5稀釋度，即3.15PFU/ml時(shí)可以完全中和IPNV病毒的感染，其中和效應(yīng)比未免疫的兔血清高了10倍。 5．IPNVVP2

13、e片段在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位 將已經(jīng)克隆的VP2e片段與綠色增強(qiáng)蛋白(EGFP)基因利用BactoBac表達(dá)系統(tǒng)在Tn-581.4細(xì)胞中分別進(jìn)行了融合與非融合表達(dá)。未融合EGFP的重組病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物在32kDa左右，比預(yù)計(jì)的VP2e分子量(23kDa)再加上6×His大約26kDa稍大，與BmNPVBactoBac系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)物的大小一致。VP2e在Tn細(xì)胞中與EGFP融合表達(dá)后在熒光顯微鏡下發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光