豬源腸外致病性大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因vca0107基因缺失突變株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究.pdf

1、腸外致病性大腸桿菌（ExtraintestinalpathogenicEscherichiacoli,ExPEC）是一類能引起人畜腸外組織與器官感染的重要人畜共患傳染病病原，可通過其特有的毒力因子（菌毛、粘附素、鐵相關(guān)蛋白等）侵襲并定植于腸外的不同組織與器官，誘發(fā)不同宿主產(chǎn)生腦膜炎，敗血癥與泌尿道感染等癥狀。隨著ExPEC對養(yǎng)豬業(yè)的危害以及相應(yīng)的全球醫(yī)療業(yè)上巨額的財政支出，并且發(fā)現(xiàn)ExPEC的危害甚至高于廣受關(guān)注的E.coli0157∶

2、H7，應(yīng)該受到公共衛(wèi)生意義上的廣泛關(guān)注。人們對ExPEC的認識和研究越來越多，ExPEC可以通過食物源進行傳播，飲用水與食物等污染可導(dǎo)致疾病的爆發(fā)，嚴重者，可危及人和動物的生命。對家畜業(yè)而言，該菌群能夠?qū)е录倚螽a(chǎn)生肺炎、腎炎、腦膜炎和敗血癥等病癥。ExPEC是誘發(fā)豬產(chǎn)生肺炎和新生兒腦膜炎等癥狀的重要致病因子之一。
　　細菌的許多分泌性蛋白和毒素都是通過分泌系統(tǒng)而被運輸?shù)郊毎w外或者直接運輸?shù)剿拗骷毎w內(nèi)，然后與宿主細胞相互作用而使

3、分泌蛋白和毒素發(fā)揮毒性。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少六種分泌系統(tǒng)(T1SS-T6SS)，而T6SS雖然是最近幾年發(fā)現(xiàn)的一種新型分泌系統(tǒng)，但是學(xué)者們對于T6SS的研究可以追溯到數(shù)十年前，而且經(jīng)過基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)已經(jīng)測序的革蘭氏陰性菌中有25％的都含有編碼T6SS的基因，而且其保守度很高。T6SS通常是由12-25個亞基組成的，其中一些蛋白VgrG、Hcp和VAS等的部分功能已經(jīng)被證實，而其他大部分的蛋白功能尚且未知。
　　本實驗室對已經(jīng)全基

4、因測序的腸外致病性大腸桿菌強毒株P(guān)CN033與弱毒株P(guān)CN061進行基因組學(xué)和比較基因組學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)PCN061中沒有編碼T6SS的基因簇，表明T6SS在腸外致病性大腸桿菌致病過程中可能發(fā)揮重要作用，因此以本室分離的PCN033菌株為親本菌，其血清型為O11，D群系，我們?nèi)笔6SS中功能未知的基因vca-0107，構(gòu)建vca-0107基因缺失突變株，研究其功能和生物學(xué)特性。主要內(nèi)容包括:
　　1.構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒
　　

5、參照PCN033全基因測序的結(jié)果設(shè)計vca-0107上下游片段的引物，擴增vca-0107基因的上下游同源臂。將得到的上下游片段同時連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)過PCR和雙酶切雙重驗證正確，然后上下游片段先后連接中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBluescriptⅡSK(+)上，再次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)過PCR和雙酶切驗證正確之后，將成功連接的上下游連接片段連接到攜帶氯霉素抗性(Cm)的自殺性質(zhì)粒pRE112上。
　　2

6、.接合轉(zhuǎn)移與篩選鑒定缺失株P(guān)CN33Δvca0107
　　vca-0107上下游同源臂與自殺性質(zhì)粒pRE112成功連接之后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌X7213（生長時需加入DAP）中，PCR鑒定重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化后，以成功轉(zhuǎn)化了重組自殺性質(zhì)粒pREΔvca-0107的大腸桿菌X7213為供體菌，而親本菌株P(guān)CN033則為受體菌進行接合轉(zhuǎn)移，通過同源重組進行同源臂之間的交換。涂布含有氯霉素抗性的LA平皿，然后篩選對蔗糖敏感的接合子，進

7、一步用PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到親本菌株的染色體中。鑒定正確后，在LB培養(yǎng)基（不含NaCl）中培養(yǎng)傳代促使第二次同源重組的發(fā)生。涂布無抗生素的LA平皿，利用氯霉素抗性篩選出Cm敏感(CmS)克隆，并進行PCR鑒定，確定發(fā)生了第二次交換，重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)丟失以及vca0107基因已經(jīng)缺失。從而成功構(gòu)建基因缺失株P(guān)CN033Δvca-0107。
　　3.缺失株生物學(xué)特性的研究
　　將缺失株和親本株同時進行活菌涂板計數(shù)，

8、繪制生長特性曲線圖，結(jié)果表明，缺失株P(guān)CN33Δvca-0107與親本菌比較，生長速度沒有明顯變化，說明vca-0107基因的缺失對PCN33的生長沒有很大影響。
　　測定親本菌和缺失菌在4周齡昆明雌性SPF小鼠體內(nèi)的毒力，根據(jù)公式計算LD50的值，結(jié)果顯示，與親本菌PCN033比較，基因缺失株P(guān)CN33Δvca-0107的毒力無明顯變化。通過比較缺失株和野生株的細胞粘附入侵能力，發(fā)現(xiàn)粘附能力有變化，而入侵能力變化不大，比較其吞噬