Erk1-2信號(hào)通路在七氟烷后處理減輕缺血再灌注大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡中的作用.pdf

1、目的：隨著近年來(lái)心臟外科、血管外科和神經(jīng)外科等逐步突破原來(lái)被視為的“禁區(qū)手術(shù)”，給圍術(shù)期管理帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)與機(jī)遇。長(zhǎng)時(shí)間的體外循環(huán)，大血管阻斷以及失血性休克等造成的重要臟器缺血再灌注，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)圍術(shù)期缺血再灌注損傷，已成為圍術(shù)期早期死亡和長(zhǎng)期預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素。雖然圍術(shù)期管理醫(yī)生，特別是麻醉醫(yī)生，在不斷研發(fā)和利用各種藥物或設(shè)備提高腦組織對(duì)血流減少或阻斷后的耐受力，減少血管再通血流恢復(fù)灌注后所導(dǎo)致的神經(jīng)功能再受損，但由于中樞神

2、經(jīng)系統(tǒng)分子信號(hào)的復(fù)雜調(diào)控，以及神經(jīng)元的不可再生性，圍術(shù)期腦保護(hù)的研究一直未取得顯著地進(jìn)展。當(dāng)今圍術(shù)期管理腦保護(hù)的重大課題之一則是提高神經(jīng)元缺氧耐受性，減少缺血再灌注造成的神經(jīng)功能受損。由于缺血再灌注損傷缺乏預(yù)見性，各種藥物或設(shè)備的后處理則被認(rèn)為能夠有效減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷的方法。最近，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)，低濃度的吸入性麻醉藥物七氟烷，能夠顯著改善缺血心肌和腦組織的細(xì)胞損傷與凋亡，提高生存率。然而，七氟烷后處理對(duì)神經(jīng)元

3、遭受缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制卻始終未有重大進(jìn)展，而闡明其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制則有助于研發(fā)新型靶向藥物。因此，從新的角度和方向來(lái)進(jìn)一步探討七氟烷后處理對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)再灌注的保護(hù)機(jī)制具有重要意義。
　　方法：9-10周齡SD大鼠，體重350-400g。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為7組(n=5):正常對(duì)照組（control group，C）;心肺復(fù)蘇模型組（CPR group，H）;心肺復(fù)蘇+七氟烷后處理組(SEVO+CPR group;SH);

4、心肺復(fù)蘇+七氟烷后處理+PD98059組(SEVO+CPR+PD group; SHP);七氟烷后處理組(SEVOgroup; S); PD98059組(PDgroup;P);心肺復(fù)蘇+PD98059組（CPR+PD group;HP）。SHP組、P組和HP組腦室內(nèi)注射PD98059（30μg/kg），H組、SH組、SHP組和HP組大鼠應(yīng)用氣管導(dǎo)管夾閉法心搏驟停法（窒息法）模擬全腦缺血再灌注動(dòng)物模型，其中氣管導(dǎo)管夾閉的窒息時(shí)間為10mi

5、n。SH組、SHP組和S組大鼠心肺復(fù)蘇成功后呼吸機(jī)輔助呼吸2h，同時(shí)吸入2％七氟烷作為后處理。心肺復(fù)蘇成功后72 h，采用神經(jīng)功能缺陷評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能受損情況;心肺復(fù)蘇成功24 h后，將各組大鼠處死并行生理鹽水灌注，分離大腦皮質(zhì)，采用免疫蛋白印跡法測(cè)定磷酸化Erk1/2和總磷酸化Erk1/2表達(dá);采用透射電鏡法觀察腦皮質(zhì)線粒體的超微結(jié)構(gòu);采用TUNEL免疫熒光染色，評(píng)價(jià)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率;采用氧電極法測(cè)定皮質(zhì)線粒體呼吸功能，評(píng)價(jià)線粒

6、體功能狀態(tài);采用實(shí)時(shí)定量PCR法和免疫蛋白印記法，測(cè)定大鼠皮質(zhì)Bid、Bim和Puma的表達(dá)，評(píng)價(jià)促凋亡因子的表達(dá)水平。出生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，進(jìn)行原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)，并根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將所培養(yǎng)的神經(jīng)元分為7組(n=5):正常對(duì)照組（control group;C）;氧糖剝奪模型組（Oxygen-Glucose Deprivation/Resuscitation[OGD/R] group;O）;氧糖剝奪+七氟烷后處理組(Sevoflu

7、rane+OGD/R group;SO);氧糖剝奪+七氟烷后處理+PD98059組（Sevoflurane+OGD/R+PD group; SOP）;七氟烷后處理組(SEVOgroup; S); PD98059組（PD group;P）;氧糖剝奪+PD98059組（OGD/R+PD group; OP）。SOP組、P組和HP組在氧糖剝奪前1h向培養(yǎng)基中加入PD98059(30μM/L)，O組、SO組、SOP組和OP組神經(jīng)元進(jìn)行氧糖剝奪-

8、復(fù)糖復(fù)氧，其中氧糖剝奪90 min，復(fù)糖復(fù)氧24 h，模擬全腦缺血再灌注的細(xì)胞模型。SO組、SOP組和S組在氧糖剝奪90min后，更換為正常神經(jīng)元培養(yǎng)基，同時(shí)在含有2％七氟烷的培養(yǎng)箱中孵育2h。按照各組處理24 h后，0.125％胰蛋白酶處理收獲神經(jīng)元，利用免疫蛋白印跡法測(cè)定磷酸化Erk1/2和非磷酸化Erk1/2;利用AnnexinⅤ-FITC/PI染色，應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)法測(cè)定雙染神經(jīng)元，評(píng)價(jià)神經(jīng)元凋亡率;利用MTT法測(cè)定神經(jīng)元生存率;

9、利用JC-1免疫熒光探針法，測(cè)定紅色/綠色熒光比，檢測(cè)線粒體膜電位水平(MMP)，評(píng)價(jià)線粒體結(jié)構(gòu)功能變化;利用熒光素-熒光素酶試劑盒測(cè)定神經(jīng)元內(nèi)ATP含量;利用實(shí)時(shí)定量PCR法和免疫蛋白印記法，測(cè)定大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中促凋亡因子Bid、Bim和Puma的表達(dá)水平。出生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，進(jìn)行原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)，并根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將所培養(yǎng)的神經(jīng)元分為4組(n=5):正常對(duì)照組（control group;C）;氧糖剝奪模型組(OGD/Rgr

10、oup;O);氧糖剝奪+七氟烷后處理組(Sevoflurane+OGD/R group;SO);氧糖剝奪+七氟烷后處理+PD98059組（Sevoflurane+OGD/R+PD group; SOP）;七氟烷后處理組（Sevoflurane group;S）。處理同以上實(shí)驗(yàn)。分別于開始復(fù)糖復(fù)氧的0h、2h、4h、8h、12 h和24 h，使用0.125％胰蛋白酶收獲各組原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，通過離心濾過法分離大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體、細(xì)胞質(zhì)

11、和細(xì)胞核，采用免疫蛋白印跡法分別測(cè)定大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核磷酸化Erk1/2以及總磷酸化Erk1/2的表達(dá)。出生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，進(jìn)行原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)，并根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將所培養(yǎng)的神經(jīng)元分為12組(n=5):正常對(duì)照組（control group;C）;氧糖剝奪模型組（OGD/Rgroup;O）;氧糖剝奪+七氟烷后處理組（SEVO+OGD/R group;SO）;氧糖剝奪+環(huán)孢菌素A處理組（CSA+OGD/R gro

12、up;CO）;氧糖剝奪+七氟烷后處理+蒼術(shù)苷組（SEVO+OGD/R+ATR group;SOA）;氧糖剝奪+七氟烷后處理+PD98059組（SEVO+OGD/R+PD group;SOP）;七氟烷后處理組(SEVO group;S);蒼術(shù)苷處理組(ATR group; A);環(huán)孢菌素A處理組（CSA group; CS組）;氧糖剝奪+蒼術(shù)苷處理組(OGD/R+ATR group;OA);氧糖剝奪+PD98059組(OGD/R+PD g

13、roup;OP)。氧糖剝奪90 min，復(fù)糖復(fù)氧2h后，使用0.125％胰蛋白酶收獲各組原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元。根據(jù)線粒體提取試劑盒說明，利用離心濾過法將大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中的線粒體分離出后，采用免疫蛋白印跡法分別測(cè)定大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體磷酸化Erk1/2和總磷酸化Erk1/2的表達(dá)，利用AnnexinⅤ-FITC/PI染色，應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)法測(cè)定雙染神經(jīng)元，評(píng)價(jià)神經(jīng)元凋亡率;采用MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率;利用分光光度儀測(cè)定提取的線粒體在OD540

14、nm處的吸收值，評(píng)價(jià)線粒體通道轉(zhuǎn)換孔的開放程度。
　　結(jié)果：心肺復(fù)蘇模型中，與C組比較，H組和SH組中皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞p-Erk1/2占總Erk1/2比值的升高;與H組比較，SH組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞p-Erk1/2占總Erk1/2比值高于H組;與SH比較，SHP組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞p-Erk1/2占總Erk1/2比值下降(P＜0.05)。與C組比較，H組神經(jīng)缺陷功能評(píng)分降低，線粒體超微結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高，線粒體呼吸控制率下降，促凋亡因子

15、Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與H組比較，SH組神經(jīng)缺陷功能評(píng)分上升，線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯完整，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，線粒體呼吸控制率升高，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低;與SH比較，SHP組神經(jīng)缺陷功能評(píng)分降低，線粒體超微結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高，線粒體呼吸控制率下降，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。大鼠皮質(zhì)神

16、經(jīng)元氧糖剝奪-復(fù)糖復(fù)氧模型中，與C組比較，O組和SO組神經(jīng)元p-Erk1/2占總Erk1/2比值升高;與O組比較，SO組神經(jīng)元p-Erk1/2占總Erk1/2比值高于O組;與SO比較，SOP組神經(jīng)元p-Erk1/2占總Erk1/2比值下降(P＜0.05)。與C組比較，O組神經(jīng)元凋亡率升高，生存率下降，線粒體膜電位水平下降，神經(jīng)元ATP含量下降，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與O組比較，

17、SO組神經(jīng)元凋亡率下降，生存率升高，線粒體膜電位水平升高，神經(jīng)元ATP含量升高，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.05);與SO組比較，SOP組神經(jīng)元凋亡率升高，生存率下降，線粒體膜電位水平下降，神經(jīng)元ATP含量下降，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。線粒體中，與C組和S組比較，O組神經(jīng)元經(jīng)過氧糖剝奪-復(fù)糖復(fù)氧4h、8h后，線粒體中p-Erk1/2占

18、總Erk1/2比值升高(P＜0.05);與O組比較，SO組神經(jīng)元在經(jīng)過氧糖剝奪后復(fù)糖復(fù)氧2h、4h、8h、12h、18h和24 h，線粒體中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)升高(P＜0.05)。細(xì)胞質(zhì)中，與C組和S組比較，在O組和SO神經(jīng)元在經(jīng)過氧糖剝奪后復(fù)糖復(fù)氧的2h、4h、8h、12h、18h和24h，細(xì)胞質(zhì)中p-Erk1/2占總Erk1/2比值升高(P＜0.05);與O組比較，SO組神經(jīng)元在經(jīng)過氧糖剝奪后復(fù)糖復(fù)氧4h、8h

19、、12h、18h和24h，細(xì)胞質(zhì)中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)升高(P＜0.05)。與C組和S組比較，在O組和SO神經(jīng)元在經(jīng)過氧糖剝奪后復(fù)糖復(fù)氧的2h、4h、8h、12h、18h和24 h，細(xì)胞核中p-Erk1/2占總Erk1/2比值升高(P＜0.05);與O組比較，SO組神經(jīng)元在經(jīng)過氧糖剝奪后復(fù)糖復(fù)氧2h、4h、8h、12h、18h和24 h，細(xì)胞核中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)升高(P＜0.05)。與C組比較

20、，O組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)升高，神經(jīng)元生存率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開放程度升高(P＜0.05);與O組比較，SO組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)升高，神經(jīng)元生存率升高，凋亡率下降，線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開放程度下降(P＜0.05);與O組比較，CO組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)升高，神經(jīng)元生存率升高，凋亡率下降，線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開

21、放程度下降(P＜0.05);SO組和CO組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)，神經(jīng)元生存率、凋亡率、線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開放程度無(wú)明顯差異(P＞0.05);與SO組比較，SOA組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)下降，神經(jīng)元生存率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開放程度升高(P＜0.05);與SO組比較，SOP組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)下降，神經(jīng)元生存

22、率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開放程度下降(P＜0.05);與C組比較，S組、CA組、A組和P組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)，神經(jīng)元生存率、凋亡率、線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開放程度無(wú)明顯差異(P＞0.05);與O組比較，OA組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)下降，神經(jīng)元生存率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開放程度升高(P＜0.05);與O組比較，OP組大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中p-

23、Erk1/2占總Erk1/2比值表達(dá)下降，神經(jīng)元生存率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉(zhuǎn)換孔開放程度升高(P＞0.05)。
　　結(jié)論：⑴七氟烷后處理減輕心肺復(fù)蘇后全腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能的機(jī)制，可能與增加皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Erk1/2磷酸化水平，抑制促凋亡因子Bid、Bim和Puma的表達(dá)，保護(hù)線粒體的形態(tài)以及呼吸功能相關(guān)。⑵七氟烷后處理減輕原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元在氧糖剝奪-復(fù)糖復(fù)氧處理凋亡的機(jī)制，可能與七氟烷后處理提高