Gax和chemerin-CMKLR1干預(yù)Akt-mTOR和ERK1-2通路介導(dǎo)的脂肪與血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為脂肪組織是作為能量?jī)?chǔ)存器官，在能量吸收大于消耗時(shí)儲(chǔ)存能量，而在能量不足時(shí)提供能量。但現(xiàn)在越來越多的研究證實(shí)，脂肪組織也是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官，它可以通過合成和分泌脂肪因子參與到很多生理和病理過程中，如可以影響其他器官組織的代謝，食欲，胰島素敏感性，免疫，和血管疾病等。這些脂肪因子包括脂聯(lián)素、瘦素、TNF-α、IL-6、內(nèi)脂素等。
　　Chemerin，作為一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，主要在胎盤、肝臟、白色脂肪組織中高表達(dá)。

2、它通過與它的G蛋白偶聯(lián)受體CMKLR1(又叫ChemR23)結(jié)合來參與到炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、血管功能紊亂等生理或病理活動(dòng)中。流行病學(xué)調(diào)查顯示，血漿chemerin水平與體重指數(shù)(BMI)及甘油三酯水平密切相關(guān)，且在高脂飲食小鼠體內(nèi)，血漿chemerin表達(dá)水平顯著升高。在前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，也觀察到細(xì)胞chemerin含量上升。相反地，CMKLR1缺陷的小鼠則顯示出脂肪生成能力受損，且使用RNAi敲低chemerin

3、/CMKLR1的表達(dá)會(huì)抑制前體脂肪細(xì)胞向成鼠脂肪細(xì)胞的分化。這些結(jié)果顯示，chemerin在脂肪分化、生成中發(fā)揮重要的作用。還有一些研究顯示，chemerin也參與到血管功能調(diào)節(jié)中，體外血管生成試驗(yàn)中，chemerin能夠顯著促進(jìn)毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成，增加微血管長(zhǎng)度與數(shù)量。但是，chemerin對(duì)于脂肪生成及血管形成的作用機(jī)制仍未被闡明。脂肪生成是一個(gè)很復(fù)雜的過程，它涉及到基因背景及環(huán)境因素，還有眾多的細(xì)胞因子、信號(hào)通路參與其中等。脂肪組

4、織的生長(zhǎng)也需要血管來提供營(yíng)養(yǎng)，且脂肪生成和血管生成是一個(gè)緊密聯(lián)系、相輔相成的過程。因此，找到一個(gè)合適的能夠且同時(shí)研究脂肪生成和血管生成聯(lián)系點(diǎn)的模型是很有必要的。將3T3-F442A細(xì)胞注射在裸鼠皮下，能夠長(zhǎng)成一個(gè)成熟脂肪墊，這個(gè)脂肪墊在外觀上與正常脂肪細(xì)胞幾乎無(wú)差異，并且脂肪墊中充滿新生血管，因此，這個(gè)脂肪墊是一個(gè)理想的同時(shí)研究脂肪生成和血管生成的模型。
　　在真核生物中，針對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的干預(yù)是有重大意義的。Gax，又名同型異源盒基

5、因，是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，主要在心血管系統(tǒng)中個(gè)體發(fā)育、器官形成、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移中起重要作用。以往有研究顯示Gax參與到血管生成和脂肪分化中。但Gax基因能否調(diào)節(jié)chemerin對(duì)于脂肪生成和血管生成的作用還未知。
　　綜上所述，我們提出這樣的假設(shè)，chemerin通過激活某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來促進(jìn)脂肪生成和血管生成，而轉(zhuǎn)錄抑制因子Gax基因能夠在體外和體內(nèi)模型中有效表達(dá)，并且能夠阻斷chemerin所介導(dǎo)的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)及脂肪生成和

6、血管生成。
　　第一部分 體外試驗(yàn)檢測(cè)Chemerin和Gax對(duì)于3T3-F442A前體脂肪細(xì)胞生物學(xué)功能影響的機(jī)制
　　方法
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:
　　(1)根據(jù)chemerin的濃度分組:為了檢驗(yàn)不同濃度梯度下chemerin對(duì)于前體脂肪細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，按照chemerin的濃度將前體脂肪細(xì)胞分為6個(gè)組:0ng/ml（空白對(duì)照組）組、20ng/ml組、40ng/ml組、60ng/ml組、80ng/ml組和

7、100ng/ml組。
　　(2)根據(jù)有無(wú)Akt通路抑制劑(LY294002)及chemerin分組:PBS組（空白對(duì)照組）、LY294002組、chemerin組和LY294002+chemerin組。
　　(3)根據(jù)有無(wú)ERK1/2通路抑制劑(PD98059)及chemerin分組:PBS組（空白對(duì)照組）、PD98059組、chemerin組和PD98059+chemerin組。
　　(4)按有無(wú)chemerin腺病

8、毒和（或）Gax腺病毒分組:Ad-GFP對(duì)照組、Ad-chemerin組、Ad-chemerin+Ad-Gax組和Ad-Gax組。
　　2.MTT法:檢測(cè)不同處理組的細(xì)胞增殖情況。
　　3.流式細(xì)胞術(shù):檢測(cè)不同處理組的細(xì)胞周期分布情況。
　　4.油紅O染色:檢測(cè)不同處理組的前體脂肪細(xì)胞分化情況。
　　5.蛋白免疫印跡分析:檢測(cè)不同處理組的相關(guān)蛋白如:FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、Akt/m

9、TOR和ERK1/2通路的表達(dá)情況。
　　6.細(xì)胞免疫熒光染色:檢測(cè)TRITC標(biāo)記的相關(guān)蛋白在細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.Chemerin對(duì)于前體脂肪細(xì)胞增殖的影響:通過MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與空白對(duì)照組相比，各濃度的chemerin均能夠有效地促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的增殖，且促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞增殖的能力隨著chemerin滴度的增加而逐漸增加。
　　2.LY294002對(duì)于前體脂肪細(xì)胞增殖的影響:通過MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)

10、，與空白對(duì)照組相比，LY294002（20um/ml）能夠有效地抑制前體脂肪細(xì)胞的增殖，且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞增殖。
　　3.PD98059對(duì)于前體脂肪細(xì)胞增殖的影響:通過MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與空白對(duì)照組相比，PD98059（40um/ml）能夠有效地抑制前體脂肪細(xì)胞的增殖，且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞增殖。
　　4.LY294002對(duì)于前

11、體脂肪細(xì)胞分化的影響:通過油紅O實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與空白對(duì)照組相比，LY294002(20um/ml)能夠有效地抑制前體脂肪細(xì)胞的分化，且能夠有效地抑制chemerin（100ng/ml）的促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化。
　　5.PD98059對(duì)于前體脂肪細(xì)胞分化的影響:通過油紅O實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與空白對(duì)照組相比，PD98059（20um/ml）能夠有效地抑制前體脂肪細(xì)胞的分化，且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化

12、。
　　6.重組腺病毒的轉(zhuǎn)染:經(jīng)過72小時(shí)的轉(zhuǎn)染，幾乎所有的細(xì)胞都能夠高表達(dá)GFP，且細(xì)胞免疫熒光顯示Gax集中表達(dá)在胞核而chemerin主要表達(dá)在胞質(zhì)。
　　7.Chemerin和Gax對(duì)于細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖與凋亡的影響:
　　(1)Chemerin對(duì)于細(xì)胞周期和凋亡的影響:與Ad-GFP對(duì)照組相比，在Ad-chemerin組，G2/M期細(xì)胞比例增加、細(xì)胞凋亡減少。
　　(2)Gax基因?qū)?xì)胞周期和凋亡的影響

13、:與Ad-GFP對(duì)照組相比，在Ad-Gax組，GO/G1期細(xì)胞比例增加、G2/M期細(xì)胞比例降低、細(xì)胞凋亡增加。
　　(3)Gax對(duì)于chemerin所介導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞周期和凋亡的影響:與Ad-chemerin組相比，在Ad-chemerin+Ad-Gax組，GO/G1期細(xì)胞比例增加、G2/M期細(xì)胞比例降低、細(xì)胞凋亡增加。
　　8.Chemerin和Gax對(duì)于細(xì)胞分化的影響:油紅O試驗(yàn)顯示:與空白對(duì)照組相比，Gax基因能夠有效地抑

14、制前體脂肪細(xì)胞的分化，且能夠有效地抑制chemerin的促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化。
　　9.相關(guān)細(xì)胞因子及信號(hào)通路的表達(dá)情況:
　　(1)Wertemblot:chemerin組與空白對(duì)照組比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1和p-ERK1/2的表達(dá)增加，LY294002組與空白對(duì)照組相比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、p-Akt、p-mTOR、p-p7

15、0S6K和p-4EBP1的表達(dá)降低，PD98059組與空白對(duì)照組相比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、p-ERK1/2的表達(dá)降低，而LY294002+chemerin組和PD98059+chemerin組的FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1則與空白對(duì)照組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Ad-chemerin組與Ad-GFP組比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、chemerin、CMKLR

16、1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1和p-ERK1/2的表達(dá)增加，Ad-Gax組與Ad-GFP組相比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP的表達(dá)降低，而Ad-Gax+Ad-chemerin組和Ad-GFP組的FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1則與空白對(duì)照組相比

17、較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)細(xì)胞免疫熒光的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果也與werstemblot相同。
　　結(jié)論:
　　1.Chemerin能夠通過Akt/mTOR和ERK1/2通路促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化。
　　2.Chemerin能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，而Gax能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期且能夠削弱chemerin的促周期作用。
　　3.Gax能夠抑制chemerin的促進(jìn)分化作用。
　　4.Gax能夠抑制chemerin

18、的促進(jìn)Akt/mTOR和ERK1/2通路激活作用。
　　第二部分 體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)Chemerin和Gax對(duì)于脂肪及血管生成的影響
　　方法:
　　(1)模型的建立:將2x107個(gè)3T3-F442A細(xì)胞注射到裸鼠背部皮下，分別在1周、4周、7周、10周時(shí)處死裸鼠，然后觀察不同時(shí)間段脂肪墊的生長(zhǎng)情況。
　　(2)模型分組:將裸鼠隨機(jī)分為4個(gè)組:Ad-GFP對(duì)照組、Ad-chemerin組、Ad-chemerin+Ad

19、-Gax組和Ad-Gax組。將2x107個(gè)3T3-F442A與相應(yīng)重組腺病毒毒液混合后注射到裸鼠背部皮下。
　　(3)動(dòng)物活體成像儀檢測(cè):成模第3天時(shí)，使用動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)GFP表達(dá)情況。
　　(4)顯微結(jié)構(gòu)及免疫組化檢測(cè):成模2周時(shí)，處死裸鼠。分別對(duì)不同處理組的脂肪墊進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)檢測(cè)。使用免疫組化對(duì)不同脂肪墊行FABP4、VEGF、CD31、p-ERK1/2、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1檢測(cè)

20、。
　　(5)蛋白免疫印跡分析:檢測(cè)不同處理組脂肪墊的磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)模型的建立:H&E染色顯示:在成模1周時(shí)，注射的3T3-F442A細(xì)胞仍保持成纖維細(xì)胞形態(tài);在4周時(shí)，一些前體脂肪細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì)胞形態(tài);7周時(shí)，大多數(shù)前體脂肪細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì)胞形態(tài);10周時(shí)，幾乎全部前體脂肪細(xì)胞都轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì)胞形態(tài)，并且與正常脂肪組織的形態(tài)分

21、辨不出來差別。
　　(2)腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率:在成模第3天時(shí)，使用動(dòng)物活體成像儀可以清晰地檢測(cè)到GFP熒光表達(dá)。
　　(3)H&E染色顯示:Ad-chemerin組的脂肪形態(tài)細(xì)胞數(shù)量較多且存在較多的血管，而Ad-Gax組的細(xì)胞壞死較多且?guī)缀跤^察不到血管的存在。
　　(4)免疫組化檢測(cè):①相比較Ad-GFP對(duì)照組，在Ad-chemerin組的脂肪墊中，VEGF、FABP4的表達(dá)及微血管密度(CD31)是增加的;②相比較A

22、d-GFP對(duì)照組，在Ad-Gax組的脂肪墊中，VEGF、FABP4的表達(dá)及微血管密度(CD31)是降低的;③相比較Ad-Ad-chemerin+Ad-Gax組，在Ad-Gax組的脂肪墊中，VEGF、FABP4的表達(dá)及微血管密度(CD31)是降低的。④蛋白免疫印跡分析和免疫組化檢測(cè)均顯示:Ad-chemerin組與Ad-GFP組比較，磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達(dá)增加。Ad-Gax組與Ad-GFP組比

23、較，磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　(1)使用3T3-F442A細(xì)胞注射到裸鼠皮下可以成功構(gòu)建脂肪墊模型，這個(gè)脂肪墊模型與正常脂肪組織幾乎無(wú)差別，且脂肪墊模型中充滿血管，這提供了一個(gè)能夠同時(shí)研究脂肪生成和血管生成的理想的模型。
　　(2)將腺病毒與3T3-F442A細(xì)胞混合后注入裸鼠皮下后，腺病毒在第3天時(shí)就可以被檢測(cè)到表達(dá)，且表達(dá)能夠至少穩(wěn)定存在2周。