鮑曼不動(dòng)桿菌blaOXA--23基因拷貝數(shù)與碳青霉烯耐藥水平相關(guān)性研究.pdf

1、目的:明確鮑曼不動(dòng)桿菌中blaOXA-23基因拷貝數(shù)與碳青霉烯耐藥水平之間的關(guān)聯(lián)。
　　方法:在已確定不含其它碳青霉烯酶基因的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中，挑選2株含有單拷貝blaOXA-23基因且基因分別位于轉(zhuǎn)座子Tn2006和Tn2009上的菌株，用含有亞胺培南的MH肉湯連續(xù)誘導(dǎo)傳代培養(yǎng)14天，同時(shí)將菌株用不含亞胺培南的MH肉湯培養(yǎng)并以相同方式連續(xù)傳代，做為對(duì)照。在連續(xù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，兩株細(xì)菌各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)又分為實(shí)驗(yàn)組

2、（培養(yǎng)基中含亞胺培南）和對(duì)照組（培養(yǎng)基中不含亞胺培南）2組。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)完成后，采用瓊脂稀釋法對(duì)連續(xù)傳代過程中的所有菌株的耐藥水平進(jìn)行測(cè)定，明確誘導(dǎo)傳代過程中亞胺培南的MIC變化。采用qRT-PCR對(duì)所有菌株的blaOXA-23基因表達(dá)量和拷貝數(shù)變化進(jìn)行測(cè)定，明確菌株MIC的變化趨勢(shì)與blaOXA-23基因的表達(dá)量和拷貝數(shù)變化之間的關(guān)聯(lián)。之后再測(cè)定各菌株的生長(zhǎng)曲線，計(jì)算各菌株在誘導(dǎo)傳代過程中的相對(duì)生長(zhǎng)速率變化。最后采用三代測(cè)序的手段對(duì)誘導(dǎo)菌

3、株的全基因組進(jìn)行測(cè)序，明確菌株經(jīng)過14天連續(xù)誘導(dǎo)傳代后全基因組水平上的變化，對(duì)blaOXA-23基因的拷貝數(shù)變化及其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分析研究。
　　結(jié)果:連續(xù)誘導(dǎo)傳代過程中，對(duì)照菌株的MIC維持在24μg/ml的初始狀態(tài)，而誘導(dǎo)菌株的MIC出現(xiàn)了明顯的變化。其中，XH386誘導(dǎo)菌株的MIC在亞胺培南誘導(dǎo)傳代過程中快速躍升到64-80μg/ml并保持穩(wěn)定，而XH731誘導(dǎo)菌株的MIC隨著傳代過程的繼續(xù)逐步上升至48-64μg/ml并在

4、后續(xù)傳代過程中保持穩(wěn)定。blaOXA-23基因的表達(dá)量上，對(duì)照菌株明顯低于誘導(dǎo)菌株，在連續(xù)傳代的中后期誘導(dǎo)菌株的blaOXA-23基因表達(dá)量達(dá)到峰值，但不穩(wěn)定，波動(dòng)較大。誘導(dǎo)菌株blaOXA-23基因拷貝數(shù)隨著誘導(dǎo)傳代的繼續(xù)而逐步上升，但趨勢(shì)明顯落后于MIC的變化。XH386誘導(dǎo)菌株blaOXA-23基因拷貝數(shù)最終穩(wěn)定在3-4之間，XH731誘導(dǎo)菌株的blaOXA-23基因拷貝數(shù)最終穩(wěn)定在1-2之間，各自對(duì)照菌株的blaOXA-23基因

5、拷貝數(shù)則穩(wěn)定在1左右。生長(zhǎng)速率上，誘導(dǎo)菌株的生長(zhǎng)速率明顯低于對(duì)照菌株。通過對(duì)誘導(dǎo)菌株全基因組的分析，發(fā)現(xiàn)blaOXA-23基因的倍增均通過負(fù)載該基因的轉(zhuǎn)座子倍增而實(shí)現(xiàn)。在XH386誘導(dǎo)菌株中，Tn2009在原位置附近形成了連續(xù)的4拷貝串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu);在菌株XH731中，負(fù)載blaOXA-23基因的Tn2006同時(shí)屬于轉(zhuǎn)座子Tn6022的一部分，經(jīng)過誘導(dǎo)傳代后，Tn2006在XH731基因組的另一位置發(fā)生插入，其攜帶的blaOXA-23基因

6、也同時(shí)發(fā)生倍增。Tn2009和Tn2006兩端各含有2個(gè)拷貝的插入序列ISAbal，但Tn2009兩端的插入序列方向相同，Tn2006兩端的插入序列方向相反。
　　結(jié)論:經(jīng)亞胺培南誘導(dǎo)培養(yǎng)后，菌株XH386和XH731的MIC，blaOXA-23基因表達(dá)量及拷貝數(shù)均有了明顯的上升，但三者上升的趨勢(shì)并不一致，MIC的上升速率要快于blaOXA-23基因表達(dá)量及拷貝數(shù)變化。細(xì)菌的耐藥是多種因素共同作用的結(jié)果，細(xì)菌可以通過blaOXA-