基于工業(yè)化生產(chǎn)的治療用單克隆抗體上游制備及放大工藝研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)室小試研究,確定治療用單克隆抗體上游制備工藝。根據(jù)大規(guī)模工業(yè)設(shè)備所能實(shí)現(xiàn)的控制參數(shù),以及各控制參數(shù)所能達(dá)到的范圍及精度,核對(duì)、校正和補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)室獲得的數(shù)據(jù),修訂為商業(yè)化生產(chǎn)用工藝用參數(shù)。
  方法:實(shí)驗(yàn)室小試階段通過(guò)對(duì)比,篩選不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及補(bǔ)料培養(yǎng)基,得到最優(yōu)化的培養(yǎng)工藝。放大生產(chǎn)階段,通過(guò)查閱設(shè)備文獻(xiàn)以及通過(guò)測(cè)定工業(yè)級(jí)主要生產(chǎn)設(shè)備的關(guān)鍵參數(shù),如細(xì)胞發(fā)酵罐的KLa,攪拌槳線速度等參數(shù),確定細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白表達(dá)

2、的參數(shù)范圍,然后與實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模條件下得到的工藝進(jìn)行比較,修正。
  結(jié)果:
  1.不同的培養(yǎng)基條件下,培養(yǎng)同樣長(zhǎng)的時(shí)間,7#培養(yǎng)基的整體活細(xì)胞密度有85E6個(gè)/ml,而11#培養(yǎng)基僅有18 E6個(gè)/ml,兩種培養(yǎng)基的總體活細(xì)胞密度相差5倍左右。其余培養(yǎng)基中,活細(xì)胞密度≤40 E6個(gè)/ml的,有4種;在40 E6個(gè)/ml到50 E6個(gè)/ml的,有5種;在50 E6個(gè)/ml到70 E6個(gè)/ml的,有7種;在70 E6個(gè)/ml到

3、85 E6個(gè)/ml的,有5種。
  2.不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,表達(dá)目的蛋白的差別也較大。其中5#和16#培養(yǎng)基,分別有1.7 g/L和1.6 g/L。但8#培養(yǎng)基中,目的蛋白僅有0.2 g/L。11#和9#由于在第12天活率就降低到60%以下,且細(xì)胞密度最低,無(wú)檢測(cè)表達(dá)量意義。
  3.從各組總細(xì)胞密度來(lái)看,不管是化學(xué)成分限定的多肽混合物和傳統(tǒng)的蛋白水解物,加入到兩種培養(yǎng)基中,都不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生大的影響,其波動(dòng)范圍與未添加水解

4、物的對(duì)照組沒(méi)有明顯的區(qū)別。
  4.從蛋白表達(dá)量看來(lái),media1-cd4和media2-cd3的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果最高。而且,加入化學(xué)成分限定水解物的實(shí)驗(yàn)組,其蛋白表達(dá)量在同一組實(shí)驗(yàn)的不同搖瓶中,表現(xiàn)更為穩(wěn)定。
  5.流加培養(yǎng)對(duì)目的蛋白的表達(dá)都具有積極的作用,在不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及水解物的組合中添加任意一種流加培養(yǎng)基都能有效地提高蛋白表達(dá)量。在主要質(zhì)量指標(biāo)合格的實(shí)驗(yàn)組中,以media1-cd4-F1 plus實(shí)驗(yàn)組的目的蛋白表達(dá)量

5、最高,達(dá)到2.45 g/L。
  6.在2L的生物反應(yīng)器內(nèi)攪拌槳槳尖速度1.6 m/s時(shí),細(xì)胞活率已經(jīng)開(kāi)始下降,略微降低攪拌槳速至1.4 m/s,此時(shí)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有明顯的活率下降。
  7.根據(jù)發(fā)酵罐的功率計(jì)算及放大公P/V=Ne·ρ1·n3·d52/V按單位體積輸出功率一致的原則放大,從細(xì)胞活率角度出發(fā),在(恍懨。。匕兒,下術(shù))攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在≤194RPM,在200L規(guī)模時(shí),攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在≤145 RPM。
  8

6、.在2L的小試規(guī)模生物反應(yīng)器上,在攪拌轉(zhuǎn)速100rpm,溫度37℃,通氣速率20ml/min,反應(yīng)器內(nèi)加入為75%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+25%補(bǔ)料培養(yǎng)基,測(cè)得KLa=0.002 s-1=7.2 h-1。
  9.分別檢測(cè)了2L生物反應(yīng)器、50L生物反應(yīng)器、200L生物反應(yīng)器在槳尖速度0.3m/s,0.6 m/s,1.2 m/s的條件下的KLa。
  10.采用檢測(cè)氯化鈉濃溶液的稀釋時(shí)間,驗(yàn)證了混勻時(shí)間可以滿足細(xì)胞培養(yǎng)需求。
  

7、11.根據(jù)KLa的檢測(cè)結(jié)果可知,通入空氣已經(jīng)可以滿足細(xì)胞對(duì)氧氣的需求,且通氣量應(yīng)<0.1 vvm以避免產(chǎn)生泡沫。
  結(jié)論:在治療用單克隆抗體的生產(chǎn)過(guò)程中,由于生產(chǎn)規(guī)模的變更,會(huì)導(dǎo)致蛋白生產(chǎn)條件的變化,從而引起蛋白特性的改變,進(jìn)而影響藥品質(zhì)量。而由于生物制品的生產(chǎn)過(guò)程成本高昂,無(wú)法在工業(yè)級(jí)規(guī)模下進(jìn)行工藝條件摸索,因此,通過(guò)關(guān)鍵參數(shù)的有針對(duì)性的工藝放大,可以在有限的成本及時(shí)間資源條件下,測(cè)試、鎖定工藝,使生產(chǎn)的產(chǎn)品特性與小試階段一致

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