基于工業(yè)化生產(chǎn)的治療用單克隆抗體上游制備及放大工藝研究.pdf

1、目的:通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)室小試研究，確定治療用單克隆抗體上游制備工藝。根據(jù)大規(guī)模工業(yè)設(shè)備所能實(shí)現(xiàn)的控制參數(shù)，以及各控制參數(shù)所能達(dá)到的范圍及精度，核對(duì)、校正和補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)室獲得的數(shù)據(jù)，修訂為商業(yè)化生產(chǎn)用工藝用參數(shù)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)室小試階段通過(guò)對(duì)比，篩選不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及補(bǔ)料培養(yǎng)基，得到最優(yōu)化的培養(yǎng)工藝。放大生產(chǎn)階段，通過(guò)查閱設(shè)備文獻(xiàn)以及通過(guò)測(cè)定工業(yè)級(jí)主要生產(chǎn)設(shè)備的關(guān)鍵參數(shù)，如細(xì)胞發(fā)酵罐的KLa，攪拌槳線速度等參數(shù)，確定細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白表達(dá)

2、的參數(shù)范圍，然后與實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模條件下得到的工藝進(jìn)行比較，修正。
　　結(jié)果:
　　1.不同的培養(yǎng)基條件下，培養(yǎng)同樣長(zhǎng)的時(shí)間，7＃培養(yǎng)基的整體活細(xì)胞密度有85E6個(gè)/ml，而11＃培養(yǎng)基僅有18 E6個(gè)/ml，兩種培養(yǎng)基的總體活細(xì)胞密度相差5倍左右。其余培養(yǎng)基中，活細(xì)胞密度≤40 E6個(gè)/ml的，有4種;在40 E6個(gè)/ml到50 E6個(gè)/ml的，有5種;在50 E6個(gè)/ml到70 E6個(gè)/ml的，有7種;在70 E6個(gè)/ml到

3、85 E6個(gè)/ml的，有5種。
　　2.不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，表達(dá)目的蛋白的差別也較大。其中5＃和16＃培養(yǎng)基，分別有1.7 g/L和1.6 g/L。但8＃培養(yǎng)基中，目的蛋白僅有0.2 g/L。11＃和9＃由于在第12天活率就降低到60％以下，且細(xì)胞密度最低，無(wú)檢測(cè)表達(dá)量意義。
　　3.從各組總細(xì)胞密度來(lái)看，不管是化學(xué)成分限定的多肽混合物和傳統(tǒng)的蛋白水解物，加入到兩種培養(yǎng)基中，都不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生大的影響，其波動(dòng)范圍與未添加水解

4、物的對(duì)照組沒(méi)有明顯的區(qū)別。
　　4.從蛋白表達(dá)量看來(lái)，media1-cd4和media2-cd3的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果最高。而且，加入化學(xué)成分限定水解物的實(shí)驗(yàn)組，其蛋白表達(dá)量在同一組實(shí)驗(yàn)的不同搖瓶中，表現(xiàn)更為穩(wěn)定。
　　5.流加培養(yǎng)對(duì)目的蛋白的表達(dá)都具有積極的作用，在不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及水解物的組合中添加任意一種流加培養(yǎng)基都能有效地提高蛋白表達(dá)量。在主要質(zhì)量指標(biāo)合格的實(shí)驗(yàn)組中，以media1-cd4-F1 plus實(shí)驗(yàn)組的目的蛋白表達(dá)量

5、最高，達(dá)到2.45 g/L。
　　6.在2L的生物反應(yīng)器內(nèi)攪拌槳槳尖速度1.6 m/s時(shí)，細(xì)胞活率已經(jīng)開(kāi)始下降，略微降低攪拌槳速至1.4 m/s，此時(shí)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有明顯的活率下降。
　　7.根據(jù)發(fā)酵罐的功率計(jì)算及放大公P/V=Ne·ρ1·n3·d52/V按單位體積輸出功率一致的原則放大，從細(xì)胞活率角度出發(fā)，在(恍懨。。匕兒，下術(shù))攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在≤194RPM，在200L規(guī)模時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在≤145 RPM。
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6、.在2L的小試規(guī)模生物反應(yīng)器上，在攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，溫度37℃，通氣速率20ml/min，反應(yīng)器內(nèi)加入為75％基礎(chǔ)培養(yǎng)基+25％補(bǔ)料培養(yǎng)基，測(cè)得KLa=0.002 s-1=7.2 h-1。
　　9.分別檢測(cè)了2L生物反應(yīng)器、50L生物反應(yīng)器、200L生物反應(yīng)器在槳尖速度0.3m/s，0.6 m/s，1.2 m/s的條件下的KLa。
　　10.采用檢測(cè)氯化鈉濃溶液的稀釋時(shí)間，驗(yàn)證了混勻時(shí)間可以滿足細(xì)胞培養(yǎng)需求。
　　

7、11.根據(jù)KLa的檢測(cè)結(jié)果可知，通入空氣已經(jīng)可以滿足細(xì)胞對(duì)氧氣的需求，且通氣量應(yīng)＜0.1 vvm以避免產(chǎn)生泡沫。
　　結(jié)論:在治療用單克隆抗體的生產(chǎn)過(guò)程中，由于生產(chǎn)規(guī)模的變更，會(huì)導(dǎo)致蛋白生產(chǎn)條件的變化，從而引起蛋白特性的改變，進(jìn)而影響藥品質(zhì)量。而由于生物制品的生產(chǎn)過(guò)程成本高昂，無(wú)法在工業(yè)級(jí)規(guī)模下進(jìn)行工藝條件摸索，因此，通過(guò)關(guān)鍵參數(shù)的有針對(duì)性的工藝放大，可以在有限的成本及時(shí)間資源條件下，測(cè)試、鎖定工藝，使生產(chǎn)的產(chǎn)品特性與小試階段一致