沙門氏苗富集及ELISA檢測方法的研究.pdf

1、沙門氏菌是自然界中普遍存在的一種食源性致病菌,在世界各地的食物中毒事件中沙門氏菌引起的病例占第一位,沙門氏菌常引起人類急性腹瀉、嘔吐、腹部疼痛、高燒和敗血癥等疾病。沙門氏菌是革蘭氏陰性腸道桿菌,無芽孢,周生鞭毛,需氧或兼性厭氧,最適生長溫度為37℃,具有復雜的抗原結(jié)構(gòu),一般可分為菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原3種。沙門氏菌危害巨大,嚴重威脅人類健康和社會經(jīng)濟的發(fā)展。因此建立一種快速、準確、簡便的檢測方法具有重要的現(xiàn)實意

2、義。本研究旨在建立一種快速簡便、特異性強的沙門氏菌免疫磁珠富集方法和雙抗夾心ELISA快速檢測方法。
　　 以福爾馬林滅活的鼠傷寒沙門氏菌和五株混合全菌抗原免疫雌性日本大耳兔,制備抗沙門氏菌多克隆抗體。分別采用辛酸.硫酸銨沉淀法和磁珠偶聯(lián)抗原吸附法純化抗體,所制備的抗體效價為3.2×105,純度較高。采用斑點雜交方法檢測抗體特異性,結(jié)果顯示抗體交叉反應現(xiàn)象較嚴重。本實驗以雜菌抗原反向吸附法純化抗體,有效消除了抗體與雜菌的交叉反應

3、,初步建立了一種高特異性多克隆抗體的純化方法。
　　 采用EDC和NHSS方法將磁珠與純化后的多克隆抗體偶聯(lián),優(yōu)化偶聯(lián)條件和免疫磁珠捕獲工藝。實驗結(jié)果表明:每毫克磁珠最佳偶聯(lián)抗體量為50微克,每次捕獲105CFU/mL沙門氏菌使用免疫磁珠量為0.3mg,免疫磁珠捕獲目的菌最佳孵育時間是45min,最佳磁分離時間是3min,受雜菌干擾小。在雞蛋清、蛋黃、牛奶基質(zhì)和純培養(yǎng)中捕獲效率分別為44.3％、43.2%、65.2%和72.5%

4、?？够旌先嗫寺】贵w制備的免疫磁珠捕獲鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、鴨沙門氏菌和腸炎沙門氏菌,捕獲效率分別為61.4%、45.8%、48.2%、78.5%和64.1%。制備所得抗沙門氏菌免疫磁珠捕獲效率較高,特異性較好。
　　 本研究以抗沙門氏菌多克隆抗體作為捕獲抗體,以C1360單克隆抗體作為檢測抗體,建立快速檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明:該方法對沙門氏菌純培養(yǎng)液的最低檢測量為1.7×1