含hNIS報告基因的乏氧調(diào)控重組質(zhì)粒構(gòu)建及其在人肺腺癌細胞株微環(huán)境乏氧檢測中應(yīng)用的實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建乏氧應(yīng)答啟動子調(diào)控的人鈉/碘共同轉(zhuǎn)運體hNIS報告基因重組質(zhì)粒，并對其在人肺腺癌A549細胞株微環(huán)境乏氧檢測中的應(yīng)用進行初步研究，為實體瘤微環(huán)境乏氧的實時監(jiān)測提供實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：(1)構(gòu)建5個串聯(lián)乏氧反應(yīng)元件(HRE)核苷酸片段，定向克隆入pGL3-promoter載體中，構(gòu)建為pGL3-promoter-5×HRE重組真核載體。然后將擴增的hNIS基因插入pGL3-promoter-5×HRE載體中，構(gòu)建為p

2、GL3-promoter-5×HRE-NIS重組質(zhì)粒。通過RT-PCR檢測載體中目的基因NIS的正確插入，并進行測序驗證。(2)以DMSO處理組作為對照，CoCl2處理人胚腎HEK293細胞模擬乏氧；將經(jīng)驗證的pGL3-promoter-5×HRE-NIS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293乏氧細胞，同時將根據(jù)乏氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）序列構(gòu)建的pcDNA3.1-HIF-1α質(zhì)粒和pGL3-promoter-5×HRE-NIS質(zhì)粒按照3∶1比

3、例轉(zhuǎn)染HEK293細胞，共轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1和pGL3-promoter-5×HRE-NIS質(zhì)粒組作為對照。通過qRT-PCR法檢測hNIS基因mRNA表達的變化；流式細胞術(shù)檢測其蛋白水平表達變化。99m高锝酸鹽(99mTcO4-)處理雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HEK293細胞，洗脫游離高锝酸鹽后通過γ計數(shù)器采集細胞放射性計數(shù)檢測所表達hNIS蛋白的功能。(3)用不同濃度CoCl2處理轉(zhuǎn)染后細胞誘導(dǎo)乏氧，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pGL3-promot

4、er-5×HRE-NIS重組質(zhì)粒于人肺腺癌A549細胞中，轉(zhuǎn)染后用qRT-PCR法檢測hNIS、HIF-1α基因mRNA表達的變化；免疫熒光染色觀察其蛋白表達情況。同樣條件下，用99mTcO4-處理細胞，洗脫游離高锝酸鹽后用1，計數(shù)器采集細胞放射性計數(shù)。
　　 結(jié)果：基因測序結(jié)果提示所構(gòu)建含hNIS報告基因的質(zhì)粒產(chǎn)物與預(yù)期一致，序列無堿基的突變。在人胚腎HEK293細胞，共轉(zhuǎn)染HIF-1α質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染pGL3-promoter-

5、5×HRE-NIS的CoCl2處理組，其hNIS基因的表達量明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及DMSO處理組。共轉(zhuǎn)染HIF-1α質(zhì)粒組細胞的99mTcO4-攝取率顯著高于空質(zhì)粒對照組(P＜0.01=。在CoCl2誘導(dǎo)乏氧的人肺腺癌A549細胞中，轉(zhuǎn)染pGL3-promoter-5xHRE-NIS真核表達載體后，低濃度CoCl2處理組hNIS、HIF-1α基因mRNA表達較空白對照組及高濃度處理組均明顯增高(P＜0.01)，蛋白表達及核素攝取計數(shù)呈現(xiàn)一

6、致變化趨勢，且hNIS蛋白能正確表達于細胞膜上。
　　 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建含有hNIS報告基因的pGL3-promoter-5×HRE-NIS重組質(zhì)粒；(2)含hNIS報告基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人胚腎HEK293細胞后，外源性hNIS基因能間接反應(yīng)HIF-1α基因表達，對低氧有響應(yīng)；(3)模擬細胞微環(huán)境乏氧條件下，人肺腺癌A549細胞中轉(zhuǎn)染含hNIS報告基因的重組質(zhì)粒后，外源性hNIS基因能響應(yīng)HIF-1α基因的表達，正確轉(zhuǎn)錄