利用GST Pull-down在鰭斑青鳉中篩選與Pod1相互作用的蛋白質(zhì).pdf

1、Pod1作為真核細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子—bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中蛋白質(zhì)，既能特異識(shí)別并結(jié)合DNA非編碼序列調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，也能與其他蛋白質(zhì)相互協(xié)同參與哺乳動(dòng)物性腺發(fā)育，腎臟、肺、脾臟、心臟等主要器官的形成，以及腫瘤抑制、機(jī)體免疫等多種生命調(diào)控。本研究以作者發(fā)現(xiàn)的中國魚類新紀(jì)錄種—鰭斑青鳉為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，篩選與Pod1相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)而推測其可能的功能，研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)利用日本青鳉的序列信息設(shè)計(jì)出酶切位點(diǎn)修飾引物

2、，從鰭斑青鳉性腺組織中擴(kuò)增出pod1、sf1、bmp4、妒和hdac1、arα、arβ7個(gè)基因編碼區(qū)片段，克隆至pEASY-T5 Zero載體，并測序得到驗(yàn)證。
　　(2)將克隆至T載體的7個(gè)基因編碼區(qū)片段，通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切，T4 DNA連接酶重新連接，成功構(gòu)建出7種重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-pod1和pGEX5X1-sf1/bmp4/tcf3/hdac1/ara/arβ，并雙酶切及測序得到驗(yàn)證。
　　(3

3、)將7種重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)、OrigamiB(DE3)四種宿主菌株內(nèi)，在不同的IPTG誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)時(shí)間等條件下誘導(dǎo)表達(dá)，篩選出最佳的誘導(dǎo)條件，并用6His和GST標(biāo)簽單克隆抗體通過Western blot驗(yàn)證了所表達(dá)的融合蛋白。
　　(4)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色分析表明，Pod1融合蛋白獲得很好的表達(dá)效果，幾

4、乎都是可溶的活性蛋白且占總蛋白的50％以上，包涵體蛋白質(zhì)極少;而Sf1、Bmp4、Tcf3、Hdac1四種融合蛋白表達(dá)形式以可溶性蛋白為主，目的蛋白與宿主菌自身蛋白質(zhì)相比條帶最亮;此外，Arα、Arβ兩種蛋白質(zhì)在多種誘導(dǎo)條件下都沒有獲得好的表達(dá)效果，Western blot顯示它們沒有表達(dá)。
　　(5)使用Ni-NTA樹脂從細(xì)菌裂解液中得到純化的Pod1融合蛋白，再用Millipore超濾離心管脫鹽處理后充當(dāng)Prey蛋白，分別與結(jié)