傷寒沙門(mén)菌RNases對(duì)ncRNA T3956胞內(nèi)水平的影響.pdf

1、目的:
　　 近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌中的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA),可作為基因表達(dá)調(diào)控因子,在細(xì)菌的物質(zhì)代謝、毒力、環(huán)境適應(yīng)和群體感應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在細(xì)菌體內(nèi),核糖核酸酶類(ribonucleases,Rnases)對(duì)ncRNA在胞內(nèi)水平和作用起到影響作用,本研究擬觀察傷寒沙門(mén)菌核糖核酸酶對(duì)新發(fā)現(xiàn)的ncRNAT3956在胞內(nèi)水平的影響。
　　 方法:
　　 1.傷寒沙門(mén)菌

2、Rnase G、Rnase E、Rnase Ⅲ缺陷變異株的制備:采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備各種傷寒沙門(mén)菌Rnase缺陷變異株。根據(jù)傷寒沙門(mén)菌基因組序列信息設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增目的基因上、下游同源性片段,定向連接成目的基因缺損型同源核苷酸片段,并與自殺質(zhì)粒pGMB151相連后經(jīng)電擊法導(dǎo)入傷寒沙門(mén)菌野生株,在5%蔗糖LB平板上培養(yǎng),誘導(dǎo)同源重組,通過(guò)PCR篩選及目的基因序列分析鑒定,最終獲得Rnase G、Rnase E、Rnase Ⅲ缺

3、陷變異株。
　　 2.傷寒沙門(mén)菌rng基因缺陷回補(bǔ)株的制備:根據(jù)傷寒沙門(mén)菌野生株基因組序列信息,在rng基因上下游設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得rng基因回補(bǔ)所需的DNA片段,與表達(dá)載體pBAD/gⅢ定向連接后,克隆至大腸埃希菌DH5a,篩選陽(yáng)性質(zhì)粒,經(jīng)序列分析鑒定后將陽(yáng)性重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別電擊導(dǎo)入傷寒沙門(mén)菌rng缺陷變異株中,作為rng基因缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒對(duì)照株。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析:

4、將傷寒沙門(mén)菌野生株、Rnase G缺陷株、Rnase E缺陷株和Rnase Ⅲ缺陷株在等滲LB培養(yǎng)液中(37℃,250r/min),分別提取OD600值各為0.2、0.8和1.2時(shí)期的總RNA,用特異性引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR,分析比較ncRNA T3956在傷寒沙門(mén)菌野生株、rng缺陷變異株、rng缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒對(duì)照株中不同生長(zhǎng)時(shí)期的胞內(nèi)水平,反映Rnase G、Rnase E、Rnase Ⅲ對(duì)ncRNA T395

5、6胞內(nèi)水平的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)PCR及序列分析證實(shí),成功構(gòu)建傷寒沙門(mén)菌Rnase G、Rnase E、Rnase Ⅲ缺陷變異株。
　　 2.PCR及序列分析結(jié)果表明,成功構(gòu)建陽(yáng)性重組質(zhì)粒pBAD-rng,并將重組質(zhì)粒pBAD-rng和空質(zhì)粒pBAD/gⅢ分別導(dǎo)入rng基因缺陷變異株中,成功制備rng基因缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒對(duì)照株。
　　 3.qRT-PCR分析結(jié)果表明,在傷寒沙門(mén)菌Rnase