姜黃素對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)、增殖和凋亡影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 冠心?。–oronaryArteryDisease，CAD）嚴(yán)重危害人民健康，是目前是世界及我國首要致死原因。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查冠心病發(fā)病率逐年遞增。冠心病的病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)，也是導(dǎo)致冠心病病理生理變化的重要原因，隨著AS的進(jìn)展，最終有可能導(dǎo)致管腔狹窄、斑塊破裂而引起急性心臟事件危害生命。血管平滑肌細(xì)胞(Vscularsmoothmusclecells，VSMCs)是

2、構(gòu)成血管壁的重要組成成分，平滑肌細(xì)胞增生、遷移貫穿動(dòng)脈粥樣硬化全過程，因此探討調(diào)節(jié)VSMCs生理病理功能，對(duì)防治AS具有重要意義。
　　 氧化型低密度脂蛋白（Oxidizedlow-densitylipoprotein，Ox-LDL）促進(jìn)AS形成的作用已被大量的研究所證實(shí)。目前認(rèn)為AS形成初期步驟是低密度脂蛋白(Low-densitylipoproteincholesterol，LDL)進(jìn)入內(nèi)皮損傷部位的血管壁，氧化、誘導(dǎo)多種趨

3、化因子，并激活單核細(xì)胞分泌不同的生長因子和細(xì)胞因子，刺激平滑肌細(xì)胞遷移、增殖。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)是具有趨化及活化單核/巨噬細(xì)胞作用的重要趨化細(xì)胞因子之一，可由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，血液中的單核細(xì)胞在MCP-1作用下發(fā)生遷移并聚集在血管內(nèi)膜下發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)如吞噬脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞。另外，AS的過程中血管平滑肌的增殖也在其形成過程中起到

4、了重要作用，動(dòng)脈中的血管平滑肌細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，平滑肌?xì)胞從內(nèi)膜基底部移行入內(nèi)膜層，而且大量增生并產(chǎn)生膠原纖維和蛋白多糖，最終導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，使病變演變?yōu)槔w維斑塊。在AS病變初期，血管壁細(xì)胞數(shù)量增多、內(nèi)膜增厚、管腔變窄，除了與VSMCs過度增殖有關(guān)，還與凋亡率下降導(dǎo)致細(xì)胞累積、數(shù)量增多密切相關(guān)。由此可見，MCP-1在AS的發(fā)生發(fā)展中起到扮演重要角色，提示抑制MCP-1的表達(dá)分泌和細(xì)胞過度增殖可以作為一個(gè)AS治療的重要靶點(diǎn)。姜黃素（

5、Curcumin）是從姜黃、郁金、莪術(shù)等植物中提取的一種中藥單體，屬于生物多酚化合物，研究顯示姜黃素具有抗炎、抗氧化、促細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖等藥理作用，這些作用理論上可有效拮抗AS的發(fā)生與發(fā)展，但是其具體作用機(jī)制不甚清楚。因此，本研究以VSMCs作為模型，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，觀察姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)MCP-1表達(dá)分泌和增殖，及促凋亡影響，初步探討其可能的機(jī)制。
　　 研究目的：
　　 以大鼠主動(dòng)脈分離后原代培養(yǎng)

6、的VSMCs為研究對(duì)象，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如蛋白免疫印跡(Westernblot)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)、四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)檢測等，觀察姜黃素對(duì)其分泌MCP-1和增殖、促凋亡的影響，探討其可能的相關(guān)機(jī)制，進(jìn)一步揭示姜黃素在心血管藥理學(xué)方面的分子機(jī)制，為姜黃素在心血管疾病治療上的應(yīng)用提供理論依據(jù)

7、。
　　 研究方法：
　　 第一章姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞MCP-1分泌的影響及相關(guān)信號(hào)通路的研究
　　 取SD雄性大鼠，處死后分離胸主動(dòng)脈，去除外膜和內(nèi)膜，按常規(guī)組織貼塊方法原代培養(yǎng)并傳代，實(shí)驗(yàn)取用3-8代細(xì)胞，免疫組化法通過顯示α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SM-actin)陽性表達(dá)鑒定為血管平滑肌細(xì)胞。
　　 細(xì)胞毒性試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分組:1）正常對(duì)照組，2）

8、姜黃素(5μM)組，3）姜黃素(10μM)組，4）姜黃素(20μM)組，5）姜黃素(40μM)組，6）姜黃素(80μM)組;放入孵箱中干預(yù)24h，采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測存活率，目的是排除在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)引起細(xì)胞因子分泌水平減少是由于藥物引起細(xì)胞數(shù)量減少所致的可能;
　　 Ox-LDL對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞MCP-1分泌的影響:實(shí)驗(yàn)(1)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL(10μg/ml)組，3）Ox-LD

9、L(50μg/ml)組，4）Ox-LDL（100μg/ml）組，干預(yù)24h;實(shí)驗(yàn)(2)分組:100μg/mlOx-LDL(0、6、12、24h)作用不同時(shí)間作用組。ELISA檢測細(xì)胞上清中MCP-1的濃度。
　　 姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1)正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（l00μg/ml）組，3）Ox-LDL(100μg/ml)+姜黃素(5μM)組，4）Ox-LDL（100μg/m

10、l）+姜黃素（10μM）組，5）Ox-LDL(100μg/ml)+姜黃素(30μM)組，通過ELISA和RT-PCR檢測細(xì)胞上清MCP-1濃度和細(xì)胞中MCP-1mRNA表達(dá)情況。
　　 不同促分裂原活化蛋白激酶MAPK(Mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)信號(hào)通路(JNK，ERK1/2，p38MAPK)抑制劑和核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路抑制劑(BAY11-7082)對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞

11、MCP-1分泌的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（100μg/ml）組，3）Ox-LDL（100μg/ml）+SP600125（JNK抑制劑）組，4）Ox-LDL(100μg/ml)+PD98059(ERK1/2抑制劑)組，5）Ox-LDL(100μg/ml)+SB203580（p38抑制劑）組，6）Ox-LDL（100μg/ml）+BAY11-7082（NF-κB抑制劑）組，通過ELISA對(duì)細(xì)胞上清MCP-1進(jìn)行檢測，

12、通過此實(shí)驗(yàn)確定引起MCP-1分泌可能被介導(dǎo)的信號(hào)通路，為下一個(gè)實(shí)驗(yàn)提供參考。
　　 p38抑制劑(SB203580)和NF-κB抑制劑(BAY11-7082)對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞磷酸化p38和核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)(1)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（100μg/ml）組，3）Ox-LDL(100μg/ml)+SB203580組;通過Westernblot檢測磷酸化p38表達(dá)水平;實(shí)驗(yàn)(2)

13、分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（100μg/ml）組，3）Ox-LDL（100μg/ml）+BAY11-7082組;Westernblot檢測核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)，結(jié)合上一實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)介導(dǎo)的信號(hào)通路。
　　 姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞磷酸化p38和核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)(1)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（100μg/ml）組，3）Ox-LDL（100μg/ml）+姜黃素(5μ

14、M)組，4）Ox-LDL（100μg/ml）+姜黃素(10μM)組，5）Ox-LDL(100μg/ml)+姜黃素(30μM)，通過Westernblot檢測磷酸化p38MAPK表達(dá)情況;實(shí)驗(yàn)(2)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（100μg/ml）組，3）Ox-LDL（100μg/ml）+姜黃素(5μM)組，4）Ox-LDL（100μg/ml）+姜黃素(10μM)組，5）Ox-LDL（100μg/ml）+姜黃素(30μM)，通過W

15、esternblot檢測核內(nèi)NF-κBp65的表達(dá)情況。
　　 第二章姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制初步探討
　　 Ox-LDL對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（50μg/ml）組，3）Ox-LDL（100μg/ml）組，4)Ox-LDL（200μg/ml）組，5）Ox-LDL（300μg/ml）組，采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法

16、(MTT)檢測，在酶標(biāo)儀上測得OD值代表細(xì)胞增殖程度;
　　 姜黃素對(duì)Ox-LDL(100μg/ml)誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（100μg/ml）組，3）Ox-LDL(100μg/ml)+姜黃素(20μM)組，4）Ox-LDL（100μg/ml）+姜黃素(40μM)組，5）Ox-LDL（100μg/ml）+姜黃素(80μM)組，采用MTT檢測，在酶標(biāo)儀上測得OD值代表細(xì)胞增殖程度;<

17、br>　　 血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)抑制劑(ZnPPⅨ)對(duì)姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox-LDL（100μg/ml）組，3）Ox-LDL(100μg/ml)+姜黃素(80μM)組，4）Ox-LDL(100μg/ml)+姜黃素（80μM）+ZnPPⅨ組，采用MTT檢測，在酶標(biāo)儀上測得OD值代表細(xì)胞增殖程度;
　　 姜黃素對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞H

18、O-1mRNA和蛋白表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1)正常對(duì)照組，2）姜黃素(20μM)組，3）姜黃素(40μM)組，4）姜黃素(80μM)組，通過RT-PCR和Westernblot檢測細(xì)胞HO-1mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的情況;
　　 HO-1抑制劑(ZnPPⅨ)對(duì)姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）正常對(duì)照組，2）Ox

19、-LDL(100μg/ml)組，3）Ox-LDL(100μg/ml)+姜黃素(80μM)組，4)Ox-LDL（100μg/ml）+姜黃素(80μM)+ZnPPⅨ組，通過Westernblot檢測細(xì)胞中PCNA表達(dá)水平;
　　 第三章姜黃素誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響的初步探討
　　 姜黃素對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡影響:實(shí)驗(yàn)(1)分組:1）正常對(duì)照組，2)姜黃素(50μM)組，3）姜黃素(100μM)組;通過HOECHST

20、33342細(xì)胞染色熒光顯微鏡觀察姜黃素對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡形態(tài);實(shí)驗(yàn)(2)分組:）正常對(duì)照組，2）姜黃素(50μM)組，3）姜黃素(100μM)組，4）姜黃素(120μM);通過AnnexinV-FITC和PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;
　　 姜黃素對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞caspase-8p10的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）正常對(duì)照組，2）姜黃素(50μM)組，3）姜黃素(100μM)組，4）姜黃素(120μM)組;通過Wester

21、nblot檢測細(xì)胞中caspase-8p10表達(dá)水平;
　　 研究結(jié)果：
　　 一、姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞MCP-1分泌的影響及相關(guān)信號(hào)通路的研究
　　 1)姜黃素在濃度范圍(0-80μM)范圍內(nèi)細(xì)胞存活率無顯著變化:姜黃素加入VSMCs后，與正常對(duì)照組比較，5μM組（P=0.634）、10μM(P=0.309)、20μM(P=0.243)、40μM(P=0.202)、80μM(P=0.163)組

22、細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2)Ox-LDL可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞分泌MCP-1，在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍呈濃度依賴性:不同濃度(10、50、100μg/ml)Ox-LDL作用于血管平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞上清中分泌的MCP-1不同程度的增加(P＜0.05)，并呈濃度依賴性，此實(shí)驗(yàn)中在100μg/ml達(dá)到最高，故此以后實(shí)驗(yàn)均采用100μg/ml濃度進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。
　　 3)Ox-LDL可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞分泌MCP-1，在本實(shí)驗(yàn)時(shí)

23、間范圍呈時(shí)間依賴性:將100μg/ml濃度的Ox-LDL作用于血管平滑肌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12、24h)后，檢測得細(xì)胞上清中的MCP-1不同程度的增加（P＜0.05），呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。
　　 4)姜黃素可抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá):將不同濃度的姜黃素預(yù)處理，再給予Ox-LDL刺激24h（100μg/ml），與對(duì)照組相比，其余各組細(xì)胞上清MCP-1明顯偏高(P=0.000，P=0.000，P=0.0

24、00，P=0.003)，差異具有顯著性。與Ox-LDL組單獨(dú)作用組比較，Ox-LDL+姜黃素(10μM)和Ox-LDL+姜黃素(30μM)組細(xì)胞上清中MCP-1明顯減低（P=0.000和P=0.000），差異具有顯著性。而Ox-LDL+姜黃素(5μM)組和Ox-LDL組單獨(dú)作用組比較無顯著差異(P=0.565)。
　　 姜黃素可抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá):RT-PCR檢測結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，其余

25、各組（Ox-LDL/姜黃素干預(yù)組）MCP-1mRNA明顯偏高（P=0.000，P=0.000，P=0.001，P=0.024），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Ox-LDL組單獨(dú)作用組比較，Ox-LDL+姜黃素(10μM)和Ox-LDL+姜黃素(30μM)組細(xì)胞MCP-1mRNA明顯減低(P=0.000和P=0.000)，差異具有顯著性。而Ox-LDL+姜黃素(5μM)組和Ox-LDL組單獨(dú)作用組比較無顯著差異(P=0.054)。
　　

26、5)p38MAPK和NF-κB介導(dǎo)Ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs表達(dá)分泌MCP-1:將不同濃度的姜黃素預(yù)處理，MAPK信號(hào)通路(JNK，ERK1/2，p38MAPK)抑制劑(SP600125，PD98059，SB203580)或NF-κB抑制劑(BAY11-7082)處理細(xì)胞1h，再給予Ox-LDL刺激30min（100μg/ml）。與Control組相比，Ox-LDL單獨(dú)作用組細(xì)胞上清中的MCP-1明顯升高，差異具有顯著性(P=0.000

27、)。與Ox-LDL組相比，Ox-LDL+SB組和Ox-LDL+BAY組細(xì)胞上清中的MCP-1明顯降低(P=0.000和P=0.002)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但是，Ox-LDL+SP組和Ox-LDL+PD組與Ox-LDL組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.536和P=0.438），通過此實(shí)驗(yàn)確定引起MCP-1分泌可能被介導(dǎo)的信號(hào)通路，為下一個(gè)實(shí)驗(yàn)提供參考。
　　 6)Ox-LDL促進(jìn)p38MAPK磷酸化和核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)上調(diào):根據(jù)上一

28、個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給予p38MAPK和NF-κB的抑制劑（SB203580和BAY11-7082）預(yù)處理細(xì)胞1h，再給與Ox-LDL(100μg/ml)組刺激30min。與對(duì)照組比較，Ox-LDL組磷酸化p38及核NF-κBp65明顯表達(dá)增加（P=0.000和P=0.000），差異具有顯著性;與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+SB組和Ox-LDL+BAY組中的細(xì)胞磷酸化p38和核NF-κBp65的水平明顯降低（P=0.006和P=0.006

29、），差異具有顯著性。
　　 7)姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞p38MAPK磷酸化及核內(nèi)NF-κBp65表達(dá):給予不同濃度姜黃素(5、10、30μM)預(yù)處理后，再給予Ox-LDL(100μg/ml)刺激30min。與對(duì)照組比較，Ox-LDL單獨(dú)作用組磷酸化p38表達(dá)水平明顯升高(P=0.000)，差異具有顯著性;與Ox-LDL單獨(dú)作用組比較，姜黃素(10、30μM)+Ox-LDL組可明顯下調(diào)磷酸化p38(P=0.000

30、和P=0.000)，差異具有顯著性。Ox-LDL單獨(dú)作用組與姜黃素(5μM)+Ox-LDL組比較磷酸化p38表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.108)。同樣地，與對(duì)照組比較，Ox-LDL單獨(dú)作用組核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)水平明顯升高（P=0.000），差異具有顯著性;與Ox-LDL單獨(dú)作用組比較，姜黃素(10、30μM)+Ox-LDL組可明顯下調(diào)核內(nèi)NF-κBp65(P=0.001和P=0.000)，差異具有顯著性。Ox-LDL單獨(dú)作用組與

31、姜黃素(5μM)+Ox-LDL組比較，核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.796）。
　　 二、姜黃素對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖影響及相關(guān)機(jī)制初步探討
　　 1)Ox-LDL可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖:將不同濃度的(50、100、200、300μg/ml)Ox-LDL刺激VSMCs24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，50、100、200μg/ml組OD值明顯升高（P=0.015，P=0.009，P=0.0

32、35），差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2)姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌增殖:前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)Ox-LDL誘導(dǎo)增殖的效應(yīng)明顯，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們著重觀察姜黃素是否存在對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)增殖的抑制效應(yīng);給予姜黃素處理細(xì)胞，再給予Ox-LDL(100μg/ml)刺激。與對(duì)照組比較，Ox-LDL組OD值明顯升高，差異具有顯著性(P=0.002)。予以姜黃素預(yù)處理，Ox-LDL+姜黃素(20μM)與Ox-LDL組比較

33、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.717)。與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+姜黃素(40μM)和Ox-LDL+姜黃素(80μM)組OD值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047和P=0.009)。
　　 3)HO-1可能介導(dǎo)姜黃素抑制Ox-LDL所誘導(dǎo)的VSMCs增殖效應(yīng):為了觀察HO-1是否介導(dǎo)了姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)，我們用HO-1抑制劑ZnPPⅨ、姜黃素單獨(dú)或共同預(yù)處理細(xì)胞，再給予Ox-LDL刺激。

34、與對(duì)照組比較，Ox-LDL組OD值明顯升高，差異具有顯著性(P=0.004)。與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+姜黃素(80μM)組OD值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016）。與Ox-LDL+姜黃素（80μM）組比較，Ox-LDL+姜黃素+ZnPPⅨ組OD值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。
　　 4)姜黃素可上調(diào)大鼠血管平滑肌細(xì)胞HO-1mRNA和蛋白表達(dá):為進(jìn)一步證實(shí)HO-1的介導(dǎo)，用不同濃度姜黃素

35、刺激VSMCs。RT-PCR結(jié)果顯示:0μM姜黃素組仍可見微量HO-1mRNA表達(dá)（0.14±0.03），與0μM組相比，20μM、40μM和80μM組HO-1mRNA水平明顯升高，且差異具有顯著性(P=0.006，P=0.000和P=0.006)。與20μM組相比，40μM組HO-1mRNA水平明顯升高，且差異具有顯著性（P=0.003）。與40μM組相比，80μM組HO-1mRNA水平明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025）

36、。同樣地，Westernblot結(jié)果顯示:與0μM組相比，20μM、40μM和80μM組HO-1蛋白表達(dá)水平明顯升高，且差異具有顯著性(P=0.014，P=0.000和P=0.000)。與20μM組相比，40μM組HO-1蛋白表達(dá)水平明顯升高，且差異具有顯著性（P=0.006）。與40μM組相比，80μM組HO-1表達(dá)水平明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。以上提示:姜黃素可上調(diào)大鼠血管平滑肌細(xì)胞HO-1表達(dá)，結(jié)合上一個(gè)實(shí)

37、驗(yàn)，認(rèn)為姜黃素上調(diào)HO-1表達(dá)介導(dǎo)抑制平滑肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
　　 5)姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的PCNA表達(dá)可被HO-1抑制劑ZnPPⅨ下調(diào):為了觀察姜黃素誘導(dǎo)的HO-1的上調(diào)表達(dá)是否影響PCNA的表達(dá)，我們用HO-1抑制劑ZnPPⅨ、姜黃素單獨(dú)或共同預(yù)處理細(xì)胞，再給予Ox-LDL刺激，Westernblot檢測PCNA水平。結(jié)果顯示:經(jīng)Ox-LDL(100μg/ml)處理細(xì)胞后，Ox-LDL組PCNA的表達(dá)顯著上調(diào)，差異具

38、有顯著性(P=0.000)。與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+姜黃素組PCNA的表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有顯著性(P=0.000)。與Ox-LDL+姜黃素組比較，Ox-LDL+姜黃素+ZnPPⅨ組PCNA的表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。
　　 三、姜黃素誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響的初步探討
　　 1)姜黃素可誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡:大鼠平滑肌細(xì)胞經(jīng)姜黃素干預(yù)之后經(jīng)Hoechst33342染色，在熒光

39、顯微鏡下觀察:正常對(duì)照組VSMCs核呈現(xiàn)藍(lán)色;給予50μM姜黃素處理24h后，可見少量細(xì)胞核會(huì)致密濃染，呈白色發(fā)亮狀態(tài);當(dāng)給予100μM姜黃素處理以后，大量細(xì)胞核呈致密濃染，略呈白色。
　　 2)流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)一步證實(shí)凋亡情況:與0μM組比較，50μM、100μM、120μM姜黃素組細(xì)胞早期凋亡數(shù)明顯增加，差異具有顯著性(P=0.024，P=0.000，P=0.000)。與50μM比較，100μM姜黃素組細(xì)胞早期凋亡數(shù)顯著增加

40、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。與100μM比較，120μM姜黃素組細(xì)胞早期凋亡數(shù)顯著增加，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。
　　 3)姜黃素上調(diào)caspase-8p10蛋白表達(dá)水平:不同濃度的姜黃素(50、100、120μM)對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞干預(yù)以后，與0μM組相比，50μM、100μM和120μM姜黃素干預(yù)組caspase-8p10蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P=0.043，P=0.001，P=0.000），差異顯著。

41、與50μM組相比，100μM姜黃素干預(yù)組caspase-8p10蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P=0.044），差異顯著。與100μM組相比，120μM組caspase-8p10蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)(P=0.011)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1)姜黃素在濃度范圍(0-80μM)范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性。
　　 2)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞中p38MAPK的磷酸化及NF-κB入核促進(jìn)MCP-1分泌表達(dá)。