人源iPSC中致聾基因MYO15A的修正對誘導獲得的毛細胞樣細胞的形態(tài)和功能的影響.pdf

1、耳聾和聽力障礙是全球性重大健康問題之一。耳是人類重要的聽覺以及平衡器官，內(nèi)耳毛細胞是聽覺轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵感覺細胞。當聲波經(jīng)過的時候，毛細胞通過其表面靜纖毛的擺動，將聲波信號轉(zhuǎn)換為電信號，并由神經(jīng)傳給大腦，從而產(chǎn)生聽覺。內(nèi)耳毛細胞的損傷或丟失是誘發(fā)耳聾和聽力喪失的主要原因之一。噪音、衰老、基因突變或藥物濫用（尤其是氨基糖苷類抗生素）都可能會導致內(nèi)耳毛細胞損傷或喪失。在哺乳動物中，包括人類，內(nèi)耳毛細胞一旦遭到破壞，將無法再生，這將導致永久性耳聾。

2、研究耳聾的發(fā)病機理，探索如何在哺乳動物（以至于人類）中再生正常內(nèi)耳毛細胞，這將為治療耳聾或聽力喪失提供幫助。
　　誘導多能干細胞(iPSC)是一類性狀極其類似于胚胎干細胞(ESC)的多能干細胞。規(guī)避倫理問題，分化能力的全能性，無限的擴增能力，獲得病人特異iPSC的能力以及自體移植不存在免疫排斥的效應，這些種種優(yōu)勢都使iPSC在再生醫(yī)學，疾病模型以及藥物篩選等領(lǐng)域擁有廣闊的應用前景?；蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn)，尤其是CRISPR/Cas9技

3、術(shù)的快速發(fā)展，使人類能夠隨心所欲的改造或是修正基因。近幾年來內(nèi)耳毛細胞再生研究的突破性進展，使哺乳動物毛細胞再生方法日趨成熟。本研究中，通過iPSC技術(shù)，我們建立了致聾基因MYO15A突變的iPSC細胞系;通過CRISPR/Cas9技術(shù)，我們將MYO15A突變iPSC細胞系中的MYO15A基因進行了修正;通過將iPSC體外誘導分化毛細胞，我們證明了MYO15A的基因校正逆轉(zhuǎn)了由MYO15A突變導致的毛細胞樣細胞的形態(tài)和功能缺陷。

4、　　第一部分:通過逆轉(zhuǎn)錄病毒，我們將來源于MYO15A突變耳聾病人(MYO15Ac.4642G＞A，c.8374G＞A)，病人父親(MYO15A c.8374G＞A)以及一個聽力正常女孩的成纖維細胞誘導成了iPSC（分別為M-/-iPSC、M+/-iPSC和M+/+iPSC）。三株iPSC都表現(xiàn)出與ESC類似的特性，例如AP陽性，表達多能干細胞特異性標志蛋白OCT4，SOX2，NANOG，SSEA4，TRA-1-60以及TRA-1-81

5、，具有體內(nèi)外三胚層分化的潛能。同時對這三株iPSC的核型進行了檢測，結(jié)果顯示，在經(jīng)過重編程的漫長過程后，三株細胞系都保持了正常的核型。
　　第二部分:通過單層貼壁誘導法，我們將三株iPSC誘導成了聽祖細胞，誘導獲得的聽祖細胞表達聽相關(guān)特異性標志蛋白與基因。通過分離聽上皮祖細胞，并與雞胚橢圓囊基質(zhì)細胞共培養(yǎng)，我們成功獲得了三株細胞的毛細胞樣細胞。誘導獲得的毛細胞樣細胞表達毛細胞特異標志基因與蛋白，能夠特異攝取FM1-43染料，具有與

6、內(nèi)耳毛細胞類似的鉀電流和鈣電流，并且在這些細胞的表面存在毛細胞特異的靜纖毛樣結(jié)構(gòu)。但同時也觀察到了MYO15A突變對M-/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。M-/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞與M+/+iPSC和M+/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞相比表現(xiàn)出肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)的紊亂以及顯著縮短的靜纖毛樣結(jié)構(gòu)。
　　第三部分:利用CRISPR-Cas9介導的同源重組技術(shù)，我們對M-/-iPSC中MYO15A c.46

7、42G＞A突變位點進行了校正。我們設(shè)計并構(gòu)建了打靶載體pX330-maxGFP-sgRNA4，同源重組模板ssODN以及pUC19-MYO15Asyonymous用于基因校正實驗。通過流式細胞分選以及Sanger測序，我們成功篩選獲得了基因校正的MC/-iPSC細胞系。MC/-iPSC維持正常細胞核型，表達多能干細胞標志基因與蛋白，且具有體內(nèi)外分化的全能性。
　　第四部分:為了了解MYO15A c.4642G＞A位點的基因校正對M

8、-/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞的結(jié)構(gòu)與功能的影響，我們將基因校正的MC/-iPSCs誘導聽祖細胞，并進一步誘導為內(nèi)耳毛細胞樣細胞。與M+/+iPSC和M+/-iPSC相似，MC/-iPSC分化的聽祖細胞，表達聽相關(guān)基因與蛋白，分化的毛細胞樣細胞，表達毛細胞特異性標記基因與蛋白。MC/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞具有與M+/+iPSC和M+/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞相似的電壓依賴電流，具有正常的肌動蛋白絲組織，正常的靜纖

9、毛長度，這與M-/-iPSC誘導獲得的毛細胞樣細胞的表現(xiàn)（肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)的紊亂以及顯著縮短的靜纖毛樣結(jié)構(gòu)）具有顯著差異。我們的研究表明MYO15A的基因校正逆轉(zhuǎn)了由MYO15A突變導致的毛細胞樣細胞的形態(tài)和功能缺陷。
　　總之，本研究通過對致聾基因MYO15A突變的iPSC細胞系的基因校正與內(nèi)耳毛細胞的誘導分化成功證明了從人iPSC誘導獲得毛細胞樣細胞的可行性，同時也證明了基因校正能有效逆轉(zhuǎn)MYO15A突變導致的毛細胞樣細胞的形態(tài)