長型NFE2L1在急性砷暴露所致MIN6胰島β細胞損傷中的作用及其機制研究.pdf

1、目的:砷是一種環(huán)境氧化應激物，長期暴露可以導致皮膚色素沉著、皮膚角化，還可能誘發(fā)多種惡性腫瘤，大量流行病學研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境砷暴露與2型糖尿病發(fā)生密切相關。由于2型糖尿病可以歸因于胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗的共同作用，因此研究胰島β細胞的功能在闡明砷致糖尿病的病理機制中至關重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子NF-E2相關因子2(Nuclear factor-related factor2，NFE2L2)介導的適應性抗氧化反應在砷導致胰島β細胞

2、急性損傷過程中起到了重要保護作用;轉錄因子NF-E2相關因子1(Nuclear factor-related factor1，NFE2L1)參與調控胰島β細胞葡萄糖刺激胰島素分泌過程;急性砷暴露可以激活長型NFE2L1。但是長型NFE2L1在砷致胰島β細胞損傷的作用尚無研究報導，本研究旨在探討長型NFE2L1在急性砷暴露導致的胰島β細胞損傷中的作用及機制。
　　研究方法:
　　1、首先利用含有shRNA的慢病毒對MIN6細胞

3、進行轉導，建立穩(wěn)轉Scramble和Nfe2l1(L)-KD MIN6細胞。
　　2、對Scramble和Nfe2l1(L)-KD MIN6細胞進行急性砷處理后，利用MTS和臺盼藍染色方法檢測細胞活力。
　　3、利用Western Blot技術檢測蛋白表達，包含凋亡相關蛋白Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP以及NFE2L1、NFE2L2水平等。
　　4、利用Real-time qPCR技術對抗

4、氧化及Ⅱ相解毒酶基因表達進行定量分析。
　　5、利用流式細胞儀測定細胞內ROS水平。
　　6、利用超低溫冷阱捕集-氫化物發(fā)生-原子吸收分光光度法測定細胞內的iAs、一甲基胂(Monomethylarsenic，MMA)和二甲基胂(Dimethylarsenic，DMA)等砷化物的含量。
　　7、通過Real-time qPCR技術篩選相關microRNA，利用microRNA類似物轉染Scramble和Nfe2l1(L

5、)-KD MIN6細胞。利用臺盼藍染色和Western Blot技術對凋亡相關蛋白Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP進行檢測，對microRNA功能進行分析。
　　結果:
　　1、通過對Scramble和Nfe2l1(L)-KD MIN6細胞中NFE2L1進行檢測，確認長型Nfe2l1在MIN6細胞中被有效沉默。
　　2、MTS檢測結果發(fā)現(xiàn)，在MIN6細胞中，急性砷處理后Nfe2l1(L)-K

6、D細胞活力降低，而臺盼藍染色后計數(shù)細胞發(fā)現(xiàn)在Nfe2l1(L)-KD細胞中死細胞數(shù)明顯多于對照組，凋亡相關蛋白Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的表達量也明顯增多。上述結果表明，長型Nfe2l1缺失會導致MIN6細胞對急性砷暴露所引起的細胞毒性更敏感。
　　3、在MIN6細胞中，抗氧化基因Gclc、Gclm和Ho-1的mRNA水平以及活性氧ROS在Scramble和Nfe2l1(L)-KD細胞中無明顯統(tǒng)計

7、學差異，因此無法從抗氧化角度解釋Nfe2l1(L)-KD對急性砷暴露敏感性增多的現(xiàn)象。而Ⅱ相解毒酶Gsto1、Gstm1和Nqo1的表達水平在Nfe2l1(L)-KD細胞中明顯高于Scramble，提示細胞內代償機制被激活。
　　4、急性砷處理后，Nfe2l1(L)-KD MIN6細胞中NFE2L2蛋白水平增加，這可能是導致上述ARE基因表達差異的原因之一。
　　5、急性砷暴露后Nfe2l1(L)-KD細胞中MMA和甲基化率

8、均顯著高于Scramble。
　　6、通過篩選發(fā)現(xiàn)，既受砷暴露影響，又受長型NFE2L1調控，且與胰島β細胞相關的microRNA是miR-184。將miR-184類似物轉染進入MIN6細胞后，進行臺盼藍染色和凋亡相關蛋白檢測，初步研究結果發(fā)現(xiàn)miR-184類似物對細胞損傷水平?jīng)]有顯著影響。
　　結論:
　　1、長型Nfe2l1沉默導致MIN6細胞對急性砷毒性更敏感，其損傷機制可能是Nfe2l1(L)-KD細胞中NFE