FTZ含藥血清改善氧化應(yīng)激引起的INS-1胰島β細(xì)胞損傷的作用及機制探究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病是一組由于胰島素抵抗及（或）胰島素分泌缺陷引起的以高血糖為特征的代謝性疾病，已成為當(dāng)前威脅人類健康的最重要的非傳染性疾病之一。持續(xù)高血糖對胰島β細(xì)胞的損傷在2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用越來越受關(guān)注。高血糖引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷的主要原因之一。
　　本實驗室前期研究表明，復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（Fufang Zhenshu TiaozhiCapsule，F(xiàn)TZ）具有降糖、降脂、抗凝、抗炎、保

2、護血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用，能同時干預(yù)脂質(zhì)的吸收、合成、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)運、分解、排泄等多個環(huán)節(jié)，對動脈粥樣硬化、高脂血癥、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病具有很好的防治作用。但FTZ是否具有改善氧化應(yīng)激引起的胰島β細(xì)胞損傷、維持胰島β細(xì)胞正常的功能和數(shù)量的作用尚不清楚。
　　目的：
　　1、探究FTZ含藥血清改善高糖引起的氧化應(yīng)激對INS-1胰島β細(xì)胞損傷的作用及機制。
　　2、探究FTZ含藥血清改善氧化應(yīng)激引起的INS-1胰島β細(xì)胞凋

3、亡的作用及機制。
　　3、探究FTZ含藥血清促進葡萄糖刺激的胰島β細(xì)胞胰島素釋放的作用及機制。
　　方法：
　　1、將40只健康雄性SD大鼠平均分為2組，即給藥組和空白組。大鼠禁食18h后灌胃FTZ混懸液，劑量為3 g提取物/kg體重?？瞻捉M灌予超純水。連續(xù)灌胃3天，一天2次，末次灌胃1 h后腹主動脈取血。血液室溫靜止1h后離心處理（3000 r/min，15 min/次，2次），分離后合并同組大鼠血清，置水浴鍋中，由

4、室溫開始升溫至56℃， 并維持30 min。0.22μm濾膜過濾，制得FTZ含藥血清和大鼠空白血清。對FTZ原料藥、FTZ含藥血清、大鼠空白血清分別進行UPLC/Q-TOF-MS分析。
　　2、培養(yǎng)INS-1胰島β細(xì)胞并進行分組，分別為對照組（Control組），模型組（Model組），陽性藥物組（Edaravone組），血清對照組（10％ Rat-serum組），低劑量含藥血清組（0.4%FTZ-serum組）、中劑量

5、含藥血清組（2%FTZ-serum）和高劑量含藥血清組（10% FTZ-serum組）。Control組細(xì)胞使用含有11 mmol/L葡萄糖溶液和10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；Model組細(xì)胞使用含25mmol/L葡萄糖溶液和10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；Edaravone組細(xì)胞使用含有25mmol/L葡萄糖溶液、200μmol/LEdaravone和10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；10%R

6、at-serum組細(xì)胞使用含25mmol/L葡萄糖溶液和10%大鼠空白血清的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；0.4% FTZ-serum組細(xì)胞使用含有25 mmol/L葡萄糖溶液、0.4%FTZ含藥血清和9.6%大鼠空白血清的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；2%FTZ-serum組細(xì)胞使用含有25 mmol/L葡萄糖溶液、2%FTZ含藥血清和8%大鼠空白血清的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；10%FTZ-serum組細(xì)胞使用含有25 m

7、mol/L葡萄糖溶液和10%FTZ含藥血清的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，給藥后，均培養(yǎng)48h。
　　3、采用DCFH-DA熒光探針試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS水平；MDA檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平；提取細(xì)胞總蛋白，采用Western Blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)Mn-SOD、CAT蛋白表達水平。
　　4、采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒通過流式細(xì)胞儀測定INS-1胰島β細(xì)胞的凋亡率；采用Caspase9活

8、性檢測試劑盒和Caspase3活性檢測試劑盒分別檢測INS-1胰島β細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白酶Caspase9和Caspase3的活性；提取細(xì)胞總蛋白，采用Western Blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl及促凋亡蛋白Bax的蛋白表達水平。
　　5、采用Rat Insulin ELISA試劑盒檢測INS-1胰島β細(xì)胞中葡萄糖刺激的胰島素釋放濃度；提取細(xì)胞總蛋白，采用Western Blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)PDX-1和G

9、lut2蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1、FTZ原料藥、FTZ含藥血清、大鼠空白血清的UPLC/Q-TOF-MS圖譜結(jié)果顯示，F(xiàn)TZ含藥血清含有一定濃度的藥物成分，大鼠空白血清中不含有藥物成分。
　　2、與Control組細(xì)胞相比，Model組細(xì)胞內(nèi)的ROS、MDA濃度顯著上升；Mn-SOD、CAT蛋白表達水平顯著下降。與Model組細(xì)胞相比，F(xiàn)TZ含藥血清可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA濃度，提高Mn-SOD、CAT

10、的蛋白表達量。
　　3、與Control組細(xì)胞相比，Model組細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表達量沒有明顯的變化，但是促凋亡蛋白Bax的蛋白表達量顯著提高，細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白酶caspase9和caspase3的活性顯著提高，細(xì)胞的凋亡率顯著上升。與Model組細(xì)胞相比，F(xiàn)TZ含藥血清可顯著提高細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表達量，降低促凋亡蛋白Bax的蛋白表達量，10%的FTZ含藥血清還可顯著降低細(xì)

11、胞凋亡蛋白酶caspase9和caspase3的活性，不同濃度的FTZ含藥血清均可顯著降低細(xì)胞的凋亡率。
　　4、與Control組細(xì)胞相比，Model組細(xì)胞的PDX-1和Glut2蛋白表達量顯著下降，葡萄糖刺激的胰島素釋放濃度也顯著降低。與Model組細(xì)胞相比，F(xiàn)TZ含藥血清可顯著提高細(xì)胞的PDX-1和Glut2蛋白表達量，2%和10%FTZ含藥血清可明顯提高細(xì)胞中葡萄糖刺激的胰島素釋放濃度。
　　結(jié)論：
　　1、F

12、TZ含藥血清可通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA濃度，提高Mn-SOD和CAT蛋白表達量，改善高糖引起的氧化應(yīng)激損傷；
　　2、FTZ含藥血清可通過提高細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表達量，抑制促凋亡蛋白Bax的蛋白表達量，降低細(xì)胞內(nèi)caspase9和caspase3的活性，改善氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡；
　　3、FTZ含藥血清可通過提高細(xì)胞內(nèi)PDX-1和Glut2蛋白表達量，提高葡萄糖刺激的胰島素釋放濃度，改善氧化