利用基因敲放技術(shù)建立胰島β細胞特異表達的Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型.pdf

1、β細胞是體內(nèi)胰島素的主要來源，在維持血糖平衡中起著關(guān)鍵作用。β細胞不僅僅是分泌胰島素的加工廠，而且還精細調(diào)節(jié)胰島素的分泌，使血糖在較窄的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。近年來，隨著人們生活水平提高及生活方式的改變，2型糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，進行性β細胞功能衰減直至β細胞功能衰竭是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要機制。對β細胞的研究也成為了糖尿病藥物治療研究的主要方向。
　　 條件性基因打靶是在常規(guī)基因打靶的基礎(chǔ)上，結(jié)合重組酶介導的位點特異性

2、重組技術(shù)發(fā)展而來的一種基因打靶技術(shù)。它可以將對特定基因的修飾限制于特定類型的細胞、組織甚至小鼠發(fā)育的特定階段。基于Cre/LoxP系統(tǒng)的條件基因打靶，通常借助同源重組將兩個LoxP位點置于靶基因中編碼重要功能域外顯子的兩側(cè)內(nèi)含子序列中，從而獲得表型正常的Flox小鼠;而后將該LoxP位點修飾的小鼠與細胞或組織特異性表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交后，可望獲得組織特異性基因剔除小鼠。其中Cre重組酶只在特定的細胞或組織中表達，并且Cre/

3、LoxP位點依賴的重組會將該細胞中的靶基因剔除，而其它類型細胞中由于沒有Cre重組酶的表達，靶基因不會被刪除而仍然保持原有的表達模式。這樣，就為我們研究某些刪除后導致胚胎期致死的基因功能提供了很好的研究工具。
　　 基因敲除小鼠模型的應用為研究哺乳動物基因功能提供了可靠的方法。本研究以胰島素2基因(Ins2)的第三個外顯子為靶位點，利用新型的基于λ噬菌體Red重組系統(tǒng)的重組工程技術(shù)，構(gòu)建在胰腺β細胞中特異性表達Cre重組酶的基因

4、敲入型打靶載體，為獲得胰腺β細胞中基因特異性敲出小鼠模型提供關(guān)鍵材料。本研究以低拷貝質(zhì)粒pBR322為骨架構(gòu)建取獲載體(retrieving vector)，應用缺口修復(Gap-Repair)的方法在λ噬菌體Red重組酶的作用下，通過同源重組亞克隆了長度約為12kb Ins基因;同時構(gòu)建一個帶有內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列、Cre重組酶序列和正負向篩選標記基因的微型打靶載體（mini-targeting vector），最后通過