2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
   膜聯(lián)蛋白Annexina2(以下簡(jiǎn)稱Anxa2)是一種鈣依賴蛋白,廣泛高表達(dá)于各種癌組織中,在腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及粘附等功能中起多重作用。本組前期研究發(fā)現(xiàn),Anxa2能夠調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力,并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白C-myc,CyclinD1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2,MMP-9的表達(dá)。這些蛋白都是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signaltransducerandactivatorof

2、transcription3,Stat3)的下游響應(yīng)因子。本組前期研究發(fā)現(xiàn),Anxa2和和Stat3間存在相互作用,但是Anxa2本身并沒(méi)有影響Stat3的表達(dá)水平。Anxa2與Stat3都是酪氨酸磷酸化蛋白,因此我們推測(cè)Anxa2可能通過(guò)自身的酪氨酸磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)Stat3的磷酸化,進(jìn)而調(diào)控Stat3下游響應(yīng)蛋白因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用點(diǎn)突變技術(shù),獲得Anxa2基因的持續(xù)激活和持續(xù)抑制的兩種突變體,通過(guò)感染/轉(zhuǎn)染技術(shù),獲得穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)蛋白

3、的細(xì)胞模型,在已有研究結(jié)果上進(jìn)一步探索Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化對(duì)于其自身活性及其調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲所起的作用,并為研究Anxa2與Star3相互作用的機(jī)制尋找新的線索。
   方法:
   1.應(yīng)用亞克隆技術(shù),獲得表達(dá)Anxa2及其第23位酪氨酸的突變體的載體質(zhì)粒,pCDH-EGFP-Anxa2WT,pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D。采用慢病毒感染以及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

4、染技術(shù),獲得表達(dá)Anxa2-WT及其突變體Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D的SK-BR-3及MCF-7穩(wěn)定細(xì)胞系。
   2.應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D對(duì)SK-BR-3和MCF-7細(xì)胞的增殖能力的影響。
   3.應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D對(duì)SK-BR-3和MCF-7細(xì)胞的克隆形成能力的影響。
  

5、 4.應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外遷移能力的影響。
   5.采用transwell小室體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D對(duì)SK-BR-3和MCF-7細(xì)胞的體外遷移、侵襲能力的影響。
   6.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)Stat3在乳腺癌患者的導(dǎo)管內(nèi)癌、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的mRNA表達(dá)水平,并分析與Anxa2

6、mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。
   7.采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)SK-BR-3細(xì)胞中Anxa2與Stat3的相互作用。
   8.應(yīng)用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)Anxa2-WT,Anxa2-Y23A,和Anxa2-Y23D對(duì)周期相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)水平的影響。
   9.應(yīng)用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)Anxa2-WT,Anxa2-Y23A,和Anxa2-Y23D對(duì)Stat3在乳腺癌細(xì)胞

7、SK-BR-3細(xì)胞核和漿中的分布和激活的影響。
   結(jié)果:
   1.亞克隆技術(shù)獲得野生型的重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-EGFP-Anxa2WT,并獲得Anxa2的突變質(zhì)粒pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D。
   2.重組/突變質(zhì)粒成功感染/轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3和MCF-7。
   3.野生型Anxa2-WT及其突變體Anxa2-Y23A,Anxa2-Y

8、23D在乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3和MCF-7中穩(wěn)定表達(dá)。
   4.免疫熒光檢測(cè)野生型Anxa2-WT主要定位于乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3和MCF-7中細(xì)胞膜和漿。
   5.Anxa2-WT和Anxa2-Y23D增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖與克隆形成能力。
   6.Anxa2-WT和Anxa2-Y23D提高乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
   7.Stat3mRNA在乳腺癌浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平明顯高于癌旁

9、組織(P<0.0001)和導(dǎo)管內(nèi)癌(P<0.0001)中的表達(dá);并與Anxa2mRNA在浸潤(rùn)性導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá)具有相關(guān)性。
   8.免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Stat3與Anxa2在SK-BR-3細(xì)胞中存在相互作用。
   9.免疫印跡發(fā)現(xiàn)總裂解液中Anxa2-WT,Y23D對(duì)Stat3表達(dá)水平?jīng)]有影響,但是生長(zhǎng)因子刺激后P-Stat3的表達(dá)水平有提高趨勢(shì),而細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)則明顯提高。
   10.免疫

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