黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶及制備魔芋低聚糖研究.pdf

1、β-甘露聚糖酶[β-1，4-D-mannan mannanohydrolase，EC 3.2.1.78]是一種能水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈β-1，4．D-甘露吡喃糖苷鍵的半纖維素酶，主要來自于微生物。它是一種有一定應用前景的新型工業(yè)用酶，目前存在發(fā)酵酶活性偏低的缺陷，導致其生產(chǎn)和應用成本高，限制了該酶的廣泛應用。本論文較系統(tǒng)研究了發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件對黑曲霉Aspereillus niger LW

2、-1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，大幅度提高了發(fā)酵酶活性，同時對酶性質和酶法水解工藝進行了研究，為指導酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應用以及進一步的分子生物學研究奠定了基礎。 通過單因素試驗、Plackett-Burman實驗和響應面分析法，確定了黑曲霉．Aspergillus niger LW-1菌株錐形瓶固態(tài)發(fā)酵的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成。為麩皮：豆餅粉=7.5：2.5(g/g)，其它物質相對于固體物料的質量分數(shù)分別為魔芋粉4％，KH<,2>PO<,4>

3、0.3％，玉米漿5％，CaCl<,2> 0.1％，MgSO<,4>0.1％，(NH<,4>)<,2>SO<,4>1％，液固比為1.5：1。通過發(fā)酵條件優(yōu)化得到了該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)基起始pH自然，培養(yǎng)溫度32℃，靜置培養(yǎng)84h。在上述最優(yōu)條件下，該菌株產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶的最高酶活達24879IU/g干曲，比未優(yōu)化前發(fā)酵酶活提高了2.27倍，是迄今為止所有報道中酶活水平最高的。 通過曲盤(大小φ20 cm×4 cm)固態(tài)

4、發(fā)酵擴大培養(yǎng)試驗，獲得了酸性β-甘露聚糖酶固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)工藝，即培養(yǎng)基最初料水比為1:1.8，起始pH自然，接種量10％(相對于干物料)，曲盤中裝料150g(以干料計)，分別于發(fā)酵28h、45h補水和翻曲，32℃培養(yǎng)72 h。在該條件下最高發(fā)酵酶活可達22250 IU/g干曲。 采用磷酸緩沖液浸提、硫酸銨分部鹽析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水層析——階段洗脫、Sephadex G-75凝膠過濾層析、DEAE

5、Sepharose：Fast Flow陰離子交換層析以及Phenyl-SepharoseCL-4B疏水層析——梯度洗脫的手段方法，從黑曲霉Aspergillus niger Lw-1 固態(tài)發(fā)酵曲中分離到相對分子質量和疏水性質非常相近的A、B兩種β-甘露聚糖酶組分，其中組分B所占酶活比例較大。純化酶的回收率為14.3％，純化倍數(shù)為38.6。采用SDS-PAGE電泳和HPLC兩種不同方法對純化的主要組分B進行鑒定，表明其為一種純酶組分。

6、 運用Sephadex G-75凝膠過濾層析和SDS-PAGE電泳測得純化酶的相對分子質量分別為41000和40000，兩種方法測定結果基本一致，表明該酶以單體形式存在；IEF-PAGE測得該酶的等電點為4.3，苯酚-硫酸法測得該酶含糖量為21.7％；氨基酸含量測定顯示，純化酶中含量較高的前五種氨基酸分別為Asp、Gly、Ser、Glu和Thr，含有較多酸性氨基酸，為酸性蛋白。 對純化酶酶學性質研究顯示，該酶最適反應溫度為7

7、0℃，60℃以下穩(wěn)定；在測試的三個溫度范圍內(nèi)，純化酶最適反應pH值均為3.5，表明該酶為酸性酶，該酶在pH3.5～8范圍穩(wěn)定。Zn<'2+>、Ca<'2+>、EDTA對酶有明顯的激活作用，Mn<'2+>對酶有較強的抑制作用，F(xiàn)e<'2+>、Pb<'2+>、Sn<'2+>、Fe<'2+>、Cu<'2+>、Al<'2+>、Ag<'+>對酶的抑制作用較弱；其它金屬離子對酶活影響不大。以上性質與粗酶試驗結果基本一致。純化酶對槐豆膠半乳甘露聚糖和

8、魔芋葡甘露聚糖的K<,m>值分別為5.1 mg/ml和1.4 mg/ml，對兩種多糖的V<,max>值分別為1429μmol·min<'-1>·mg<'-1>和625 μmol·min<'-1>·mg<'-1>，表明魔芋粉與酶的親和力大些。 采用HPLC法和HPLC-MS法對純化酶水解槐豆膠半乳甘露聚糖的產(chǎn)物進行定性和定量分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物除少量單糖甘露糖外，主要含有甘露二糖、甘露三糖，其二糖、三糖、四糖三類寡糖占總水解產(chǎn)物的49.

9、75％。該結果與眾多文獻報道的相似，表明該酶為內(nèi)切β-甘露聚糖酶。 以魔芋膠葡甘露聚糖為原料，采用黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶粗酶液進行酶法水解條件的研究，得到的優(yōu)化工藝條件為：魔芋膠(水溶液)濃度150 g/L，加酶量50 IU/g魔芋膠，50℃水解6 h。所獲酶解產(chǎn)物經(jīng)薄板層析和HPLC檢測表明主要為低聚糖以及少量單糖。利用酵母發(fā)酵法去除其中的可發(fā)酵性單糖，可以大大提高酶解產(chǎn)物中魔芋葡甘露低聚糖的含量。 本研究試驗成功了