miR-145對(duì)HepG2干細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：肝癌發(fā)生發(fā)展是多因素、多步驟綜合作用的結(jié)果，它是一個(gè)復(fù)雜的多基因疾病已成為共識(shí)。而作為目前生命科學(xué)研究熱點(diǎn)的microRNA(miRNA)，由于其在肝癌發(fā)生中具有癌基因及抑癌基因的雙重作用，亦受到廣泛關(guān)注。既往研究表明，miR-145是一種潛在的肝癌“保護(hù)性”miRNA，本研究旨在探討HepG2細(xì)胞中miR-145與肝癌干細(xì)胞之間的關(guān)系及可能的分子機(jī)制，以闡明miRNA調(diào)控細(xì)胞增殖的可能作用機(jī)制，揭示肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的規(guī)律，為肝癌的治

2、療探索一條新的思路。
　　方法：
　?。?）按常規(guī)培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞均貼壁完全后，棄去廢棄培養(yǎng)液。
　?。?）分別以siRNA-NC-FAM和shRNA-GFP為轉(zhuǎn)染物，以脂質(zhì)體Lipofectamine2000為轉(zhuǎn)染試劑，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)。
　　（3）本實(shí)驗(yàn)擬分為以下四組，分別為：miR-145模

3、擬物轉(zhuǎn)染組，模擬物陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組，只加轉(zhuǎn)染試劑的對(duì)照組以及不做任何處理的空白對(duì)照組，根據(jù)人源miR-145-5p的基因序列,設(shè)計(jì)并合成雙鏈模擬物（miR-145-5p mimics）。將miR-145-5pmimics以脂質(zhì)體Lipofectamine2000包裹，并轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞株中。
　　（4）實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)miR-145-5p的表達(dá)水平。
　?。?）轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)

4、基因OCT4蛋白表達(dá)水平。
　　（6）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)CCK-8法檢測(cè)miR-145-5p對(duì)HepG2細(xì)胞株在不同時(shí)間段(24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))生長(zhǎng)的作用。
　　（7）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物CD90 mRNA表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）用中劑量的siRNA oligo轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞效果較好；
　?。?）與各實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，miR-145-5p模擬物轉(zhuǎn)染組的miR-145表達(dá)明顯上調(diào)；