白花地膽草倍半萜內(nèi)酯EM23體外抗髓性白血病活性及機制研究.pdf

1、目的:
　　白花地膽草（Elephantopus mollis）是我國的傳統(tǒng)中藥，具有多種藥理活性。本課題組的前期工作中，從白花地膽草中分離純化得到多個倍半萜內(nèi)酯類化合物（SLs）。其中。EM23對人慢性髓性白血病細胞系K562和人急性髓性白血病細胞系HL-60顯示出較好的增殖抑制活性，但是其胞內(nèi)的分子靶標和潛在的作用機制仍然未知。本研究的目的是探究EM23的體外抗白血病活性和作用機制，為EM23進一步開發(fā)為抗髓性白血病候選藥物提

2、供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1. EM23抑制細胞增殖和細胞周期進程：首先通過CCK-8和MTT實驗檢測EM23對人髓性白血病細胞和正常哺乳細胞的增殖抑制作用；之后利用PI染色流式細胞實驗分析EM23對K562和HL-60細胞周期分布的影響。
　　2. EM23誘導(dǎo)細胞凋亡：首先通過Annexin-V-FITC/PI雙染流式細胞實驗檢測細胞凋亡的發(fā)生；之后TUNEL-DAPI雙染激光共聚焦實驗觀察EM23作用K562

3、和HL-60細胞后 DNA片段化是否增加；western blotting實驗檢測 EM23作用細胞后凋亡相關(guān)caspase蛋白表達水平的變化；線粒體膜電位下降是細胞凋亡的早期事件，我們采用熒光探針JC-1檢測EM23作用后線粒體膜電位的變化。
　　3. EM23干擾胞內(nèi)的氧化還原平衡：首先采用熒光探針 DCFH-DA檢測胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的變化；然后檢測EM23對胞內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng) Trx系統(tǒng)的影響。western bl

4、otting實驗檢測EM23作用后胞內(nèi)TrxR和Trx的蛋白表達變化，實時定量PCR（QT-PCR）檢測胞內(nèi)mRNA表達水平的變化。
　　4. EM23激活A(yù)SK1和p38/JNK/ERK MAPK：western blotting實驗檢測EM23作用后ASK1和p38、JNK、ERK三個MAPK蛋白是否被活化；CCK-8實驗檢測ERK抑制劑FR180204對EM23介導(dǎo)的增殖抑制活性的影響。
　　5. EM23對TNF-α

5、介導(dǎo)的NF-κB活化的抑制作用：免疫熒光和western blotting實驗檢測EM23對TNF-α引起的p65核轉(zhuǎn)位的影響；在細胞質(zhì)中，IκBα是NF-κB的負調(diào)節(jié)蛋白，TNF-α作用K562和HL-60細胞后導(dǎo)致IκBα降解，我們通過western blotting實驗檢測EM23對TNF-α介導(dǎo)的IκBα降解的影響；EM23和TNF-α聯(lián)合使用的腫瘤細胞增殖抑制活性通過CCK-8實驗檢測。
　　結(jié)果：
　　本研究顯示

6、，來自于白花地膽草的天然倍半萜內(nèi)酯類化合物EM23通過誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制人慢性和急性髓性白血病細胞 K562和 HL-60的增殖。磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine。PS）的外翻、細胞凋亡形態(tài)的出現(xiàn)、caspase和PARP蛋白的激活都可以證明EM23作用細胞后細胞凋亡的發(fā)生。MMP下降說明EM23誘導(dǎo)的凋亡屬于線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。機制研究的結(jié)果顯示 EM23作用細胞后可以顯著升高胞內(nèi)的ROS水平，而ROS清除劑NAC

7、幾乎可以完全逆轉(zhuǎn)EM23引起的凋亡作用，提示EM23是以一種ROS依賴性的方式來誘導(dǎo)細胞凋亡。在EM23作用后的K562和HL-60細胞中，硫氧還蛋白（Trx）和硫氧還蛋白還原酶（TrxR）的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平被顯著下調(diào)。EM23升高胞內(nèi)ROS并抑制Trx系統(tǒng)導(dǎo)致下游ASK1和MAPK通路的活化，而該活化作用同樣可以被NAC逆轉(zhuǎn)。此外，EM23抑制由TNF-α介導(dǎo)的p65入核和IκBα的降解。
　　結(jié)論：
　　本研究

8、表明，EM23通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑來抑制人髓性白血病細胞 K562和HL-60細胞的增殖。EM23可能通過對Trx抗氧化系統(tǒng)的抑制導(dǎo)致胞內(nèi)ROS的積累，隨后激活了Trx系統(tǒng)調(diào)控的下游信號通路，包括ASK1。p38。JNK和 ERK等，來發(fā)揮其誘導(dǎo)細胞凋亡的活性。此外，EM23還阻斷了TNF-α/NF-κB軸信號，提示EM23可能同時抑制了NF-κB介導(dǎo)的抗凋亡途徑來發(fā)揮其抗白血病活性。本研究第一次較為綜合地研究了EM23的體外抗白血