miR-183負(fù)調(diào)控下游靶基因PTPN4促進(jìn)肺腺癌始動(dòng)細(xì)胞侵襲遷移作用的研究.pdf

1、目的:
　　1.基于紫杉醇結(jié)合無血清培養(yǎng)獲取CD133+/CD326+A549CSLCs并驗(yàn)證miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表達(dá)。
　　2.探討miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的作用。
　　3.初步闡明miR-183調(diào)控CD133+/CD326+A549CSLCs侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　方法:
　　一.miR-183在CD133+/CD326+A

2、549CSLCs中的表達(dá)
　　1.通過課題組前期逆向誘導(dǎo)聯(lián)合藥物篩選富集肺腺癌始動(dòng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法分離培養(yǎng)CD133+/CD326+A549CSLCs;應(yīng)用流式熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)CD133+/CD326+ A549CSLCS比例;進(jìn)行激光共聚焦方法直觀觀測(cè)CD133和CD326分子標(biāo)記在富集細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)普通A549細(xì)胞和CD133+/CD326+ A549CSLCs中miR-183的表達(dá)情況

3、。
　　二.miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的作用
　　1.通過構(gòu)建miR-183慢病毒過表達(dá)和干擾載體，首先根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)并合成互補(bǔ)oligo DNA，經(jīng)過退火、連接將目的片段連接至pcDNA6.2-GW/EmGFP質(zhì)粒上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后挑取3個(gè)克隆，搖菌抽提質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證pcDNA6.2-GW/EmGFP-mi-183重組克隆中插入片段序列與設(shè)計(jì)的寡聚單鏈DNA序列一致;使用Invitr

4、ogen公司的BP重組系統(tǒng)將目的片段重組到載體pDONR221上，從平板挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證，所得結(jié)果符合設(shè)計(jì)要求;最后用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒，組裝成pLenti6.3-anti-miR-183，收集病毒原液，超速離心濃縮，并通過測(cè)定方法獲得病毒滴度。經(jīng)過測(cè)序結(jié)果顯示，我們成功構(gòu)建了pLenti6.3-miR-183和pLenti6.3-anti-miR-183慢病毒載體，并得到了較為準(zhǔn)確的病毒滴

5、度值，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)構(gòu)建miR-183過表達(dá)和干擾的CD133+/CD326+A549CSLCs，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-183在轉(zhuǎn)染慢病毒載體的CD133+/CD326+A549CSLCs中的表達(dá)。
　　3.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，并通過生物熒光技術(shù)檢測(cè)裸鼠肺部形成轉(zhuǎn)移瘤熒光強(qiáng)度;CCK8檢測(cè)miR-183過表達(dá)組CD133+/CD326+A549CSLCs增殖效應(yīng);體外Transwell實(shí)驗(yàn)

6、檢測(cè)miR-183過表達(dá)或低表達(dá)的CD133+/CD326+A549CSLCs的遷移和侵襲現(xiàn)象。
　　三.miR-183調(diào)控CD133+/CD326+A549CSLCs侵襲遷移的作用機(jī)制
　　1.基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析平臺(tái)，預(yù)測(cè)miR-183下游靶點(diǎn);雙熒光素酶基因報(bào)告載體系統(tǒng)間接驗(yàn)證miR-183下游靶基因PTPN4; qRT-PCR和westernblot直接驗(yàn)證經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染低表達(dá)miR-183的CD133+/CD326

7、+A549CSLCs中PTPN4基因和蛋白表達(dá)水平。
　　2.構(gòu)建了PTPN4過表達(dá)質(zhì)粒，并設(shè)計(jì)miR-183過表達(dá)和PTPN4過表達(dá)共轉(zhuǎn)染CD133+/CD326+A549CSLCs實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用westernblot檢測(cè)了四組中PTPN4的蛋白表達(dá)水平;重復(fù)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了四組中侵襲的細(xì)胞數(shù)。
　　3.結(jié)合臨床肺腺癌標(biāo)本，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)組織標(biāo)本中PTPN4基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　

8、1.miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表達(dá)顯著升高
　　采用臨床用紫杉醇針劑(30mg/5 ml)，加藥濃度選定0.1μmol/L，加藥時(shí)間為48h;利用活細(xì)胞與細(xì)胞碎片的質(zhì)量差異采用rpm800轉(zhuǎn)進(jìn)行離心，所得細(xì)胞克隆繼續(xù)無血清懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過兩周時(shí)間，細(xì)胞的活性能夠恢復(fù)如初，在體外可以連續(xù)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞大量成球生長(zhǎng)，細(xì)胞膜圓潤(rùn)完整，胞漿折光性好，隔天即可以傳代。流式熒光檢測(cè)技術(shù)可見富集的CD133+

9、/CD326+ A549 CSLCs比例在68％左右。
　　實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)普通A549細(xì)胞和CD133+/CD326+ A549 CSLCs中miR-183的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD133+/CD326+ A549 CSLCs中miR-183表達(dá)較普通A549細(xì)胞顯著升高。
　　2.miR-183促進(jìn)CD133+/CD326+ A549 CSLCs侵襲和遷移。
　　為進(jìn)一步研究miR-183在CD133+/CD326+

10、A549 CSLCS中的作用，我們成功構(gòu)建了miR-183慢病毒過表達(dá)和干擾載體pLenti6.3-miR-183和pLenti6.3-anti-miR-183，我們將其轉(zhuǎn)染CD133+/CD326+ A549 CSLCS，建立miR-183過表達(dá)和干擾的CD133+/CD326+ A549CSLCS，免疫熒光結(jié)果提示攜帶有GFP的慢病毒質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)CD133+/CD326+ A549CSLCS;經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-183在轉(zhuǎn)

11、染慢病毒載體的CD133+/CD326+ A549 CSLCS中的表達(dá)，pLenti6.3-miR-183轉(zhuǎn)染組中miR-183較對(duì)照組顯著升高，而在pLenti6.3-anti-miR-183轉(zhuǎn)染組中miR-183較對(duì)照組顯著降低，這一結(jié)果進(jìn)一步證明我們轉(zhuǎn)染成功。由此我們獲得了穩(wěn)定表達(dá)miR-183和anti-183的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，這些細(xì)胞為我們隨后體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究miR-183在肺腺癌始動(dòng)細(xì)胞中

12、的作用提供了細(xì)胞支撐。
　　結(jié)合課題組前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，經(jīng)裸鼠尾靜脈注射pLenti6.3-miR-183轉(zhuǎn)染的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，28天后經(jīng)生物熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)裸鼠肺部形成轉(zhuǎn)移瘤，且miR-183過表達(dá)組所形成的轉(zhuǎn)移瘤的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增強(qiáng);同時(shí)為排除CD133+/CD326+ A549 CSLCS增殖所帶來的影響，我們用CCK8對(duì)miR-183過表達(dá)組和對(duì)照組進(jìn)行了檢測(cè)

13、，結(jié)果顯示兩組無明顯差異;我們還進(jìn)行了體外Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-183過表達(dá)或低表達(dá)的CD133/CD326雙陽(yáng)性細(xì)胞的遷移和侵襲現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)miR-183過表達(dá)組較對(duì)照組產(chǎn)生遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯增多，而miR-183低表達(dá)組則較對(duì)照組遷移及侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯減少。體內(nèi)外結(jié)果均提示miR-183在CD133+/CD326+ A549 CSLCS中發(fā)揮促侵襲和遷移的作用，表明miR-183可作為致癌基因促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

14、r>　　3.miR-183通過負(fù)調(diào)控PTPN4促進(jìn)CD133+/CD326+ A549 CSLCS侵襲作用
　　我們利用targetscan、picTar、miRanda等網(wǎng)絡(luò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)miR-183潛在的下游靶點(diǎn)包括有癌基因、抑癌基因、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，細(xì)胞周期調(diào)控基因和與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，例如EGR1，PTPN4，ZEB1，PTEN和PDCD4等。
　　我們利用雙熒光素酶基因報(bào)告載體系統(tǒng)將PTPN4

15、野生型和突變型的3'-UTR區(qū)重組到pGL3質(zhì)粒載體上，然后和miR-183共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過熒光活性檢測(cè)，野生型組熒光強(qiáng)度顯著降低，而突變組無明顯變化。隨后我們又通過在基因水平和蛋白水平直接檢測(cè)經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染低表達(dá)miR-183的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，PTPN4基因和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上升。間接實(shí)驗(yàn)和直接實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了PTPN4是miR-183下游靶點(diǎn)之一。
　　我們構(gòu)建了PTPN4過表達(dá)載體

16、，并設(shè)計(jì)了共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，首先，我們應(yīng)用western blot檢測(cè)了四組中PTPN4的蛋白表達(dá)水平，可見miR-control+PTPN4過表達(dá)組PTPN4較其他三組顯著上升，miR-183過表達(dá)+vector組較其他組明顯下降;其次我們利用上述四組細(xì)胞重復(fù)了Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示miR-183過表達(dá)+vector組侵襲細(xì)胞數(shù)最多，與miR-control+vector組和miR-183過表達(dá)+PTPN4過表達(dá)組存在

17、明顯差異，而miR-control+PTPN4過表達(dá)組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)最少，較miR-control+vector組有顯著差異;最后我們對(duì)臨床肺腺癌標(biāo)本檢測(cè)了miR-183和PTPN4基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)無轉(zhuǎn)移標(biāo)本的PTPN4基因表達(dá)較有轉(zhuǎn)移標(biāo)本顯著降低;相關(guān)分析表明，在同一肺腺癌組織標(biāo)本中miR-183表達(dá)水平與PTPN4mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR-183可以通過直接負(fù)調(diào)控下游靶基因PTPN4發(fā)揮促進(jìn)CD1