當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊經(jīng)JAK2-STAT3信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)組織創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制的研究.pdf

1、促進(jìn)創(chuàng)面愈合是中醫(yī)外科臨床的主要目標(biāo)之一，鼓舞氣血以生肌斂瘡是其指導(dǎo)思想。當(dāng)歸補(bǔ)血湯又名黃芪當(dāng)歸湯、補(bǔ)血湯、芪歸湯等，是金元時(shí)代李東垣所創(chuàng)造的益氣補(bǔ)血方劑，由黃芪、當(dāng)歸組成，具有補(bǔ)氣生血的功能。充滿(mǎn)生機(jī)活力的血管網(wǎng)是氣血充盈的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，肉芽鮮活紅潤(rùn)、斂瘡收口的局部辯證之所見(jiàn)，正是氣血旺盛病機(jī)的內(nèi)涵，也是血管新生等生物學(xué)過(guò)程系統(tǒng)效應(yīng)的體現(xiàn)。
　　現(xiàn)有研究表明，中藥制劑修復(fù)創(chuàng)面的生物學(xué)過(guò)程與現(xiàn)代創(chuàng)傷修復(fù)理論一致，創(chuàng)面組織的生長(zhǎng)與存

2、活離不開(kāi)血液供應(yīng)，因此，血管新生是創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中修復(fù)細(xì)胞及組織細(xì)胞賴(lài)以生存生長(zhǎng)的重要基礎(chǔ)之一。在促血管新生的研究中，要求藥物作用時(shí)間能夠順應(yīng)創(chuàng)傷修復(fù)的規(guī)律，達(dá)到良性干預(yù)的目的。
　　課題組通過(guò)制劑學(xué)的方法，將中藥復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取物，配合緩控釋高分子材料，優(yōu)化其配比及成囊工藝，控制其藥物釋放，達(dá)到零級(jí)動(dòng)力學(xué)要求，制成控釋微囊，再載入修飾后可降解膠原原位誘導(dǎo)、促進(jìn)血管新生。
　　本研究分別以細(xì)胞模型和整體動(dòng)物模型為研究對(duì)象，以

3、本實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為技術(shù)支撐，從組織、細(xì)胞、調(diào)控蛋白再到關(guān)鍵基因，層層遞進(jìn)深入，揭示當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊促進(jìn)創(chuàng)面愈合的JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路及其相關(guān)關(guān)鍵蛋白和基因靶點(diǎn)，從一個(gè)側(cè)面闡述當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊促愈的現(xiàn)代生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及其機(jī)制。
　　首先，本研究以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為模型，分別采用CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況;采用Western blot檢測(cè)各組中STAT3、VEGF的表達(dá)情況;采用熒光

4、定量PCR，檢測(cè)各組中VEGF基因和miRNA-21的表達(dá)情況。探討JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路在當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊促血管新生中的作用。結(jié)果顯示20μg/mL當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊作用于HUVEC24h，可有效促進(jìn)HUVEC的增殖。當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊能促進(jìn)HUVEC的增殖，并上調(diào)STAT3、VEGF及VEGFmRNA，miRNA-21的表達(dá)，其促進(jìn)血管生成的作用與JAK2/STAT3信號(hào)途徑有關(guān)。AG490能有效抑制當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊對(duì)HUVE

5、C的促增殖作用，并減少STAT3、VEGF及VEGFmRNA，miRNA-21的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證說(shuō)明當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊促進(jìn)血管生成的作用確實(shí)與JAK2/STAT3信號(hào)途徑有關(guān)。
　　其次，本研究采用雞胚絨毛尿囊膜CAM實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊可有效促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管新生，其中20-60μg/ml各劑量組的促血管新生作用顯著。
　　最后，本研究采用外科方法縱行切開(kāi)背部皮膚建立了大鼠創(chuàng)傷模型，從整體動(dòng)物層面中羥脯氨酸含

6、量、HE染色肉芽組織增生情況、CD34標(biāo)記的微血管數(shù)量、masson染色膠原纖維生成情況，蛋白層面中STAT3蛋白磷酸化水平和VEGF水平，以及基因?qū)用嬷蠽EGF mRNA和miRNA-21的表達(dá)等不同層次闡述了當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊膠原在大鼠損傷模型中的修復(fù)作用。結(jié)果顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊給藥后肉芽組織中羥脯氨酸含量增加，肉芽組織毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞增生活躍，創(chuàng)面微血管數(shù)量增加，膠原纖維生成密度均勻、排列有序。當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊可激活p-ST

7、AT3和VEGF蛋白表達(dá)，上調(diào)VEGF mRNA和miRNA-21基因轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊可加快創(chuàng)面愈合，具有促進(jìn)血管新生的作用。
　　綜上所述，當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)合微囊促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用途徑之一可能是通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路完成，促進(jìn)HUVEC的增殖，并上調(diào)STAT3、VEGF及VEGFmRNA，miRNA-21的表達(dá)，增加肉芽組織中羥脯氨酸含量，促進(jìn)肉芽組織毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞增生，增加創(chuàng)面微血管數(shù)量和膠原纖維，最終實(shí)現(xiàn)