人源抗CTGF單鏈抗體二聚體的制備及其對(duì)人氣管平滑肌細(xì)胞增殖作用的影響.pdf

1、背景:哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，其病理生理特征主要包括氣道高反應(yīng)和氣道重塑。氣道重塑是氣道在炎癥因子的刺激下，發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)的改變，主要包括細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積;氣管平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)增殖和肥大;氣道上皮細(xì)胞(airway epithelial cell，AEC)的破壞和杯狀細(xì)胞的增生等。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective

2、tissue growth factor, CTGF）是近年發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)下游作用因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、ECM的沉積、血管生成、介導(dǎo)細(xì)胞粘附、刺激細(xì)胞遷移等作用;抑制其活性可有效減少ECM的沉積、細(xì)胞增殖及氣道重塑作用，這可能會(huì)成為治療支氣管哮喘的有效方法。
　　目的:制備抗結(jié)締組織生長(zhǎng)因子單鏈抗體(single-chain Fv antibody，sc

3、Fv)二聚體，并鑒定其生物活性;觀(guān)察其對(duì)人氣管平滑肌(ASM)細(xì)胞增殖的影響以及初步探討可能的作用機(jī)制。
　　方法:構(gòu)建pET28a-scFv-matrilin表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到Ecoli.BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白scFv-matrilin，經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析得到抗CTGF單鏈抗體-matrilin融合蛋白二聚體，SDS-PAGE、Native-PAGE電泳檢測(cè)其純度，ELISA法檢驗(yàn)其免疫學(xué)活性。C

4、TGF干預(yù)人氣管平滑肌細(xì)胞，以MTT法檢測(cè)氣管平滑肌細(xì)胞增殖情況。用scFv二聚體與人氣管平滑肌細(xì)胞共孵育后，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中mTOR mRNA的表達(dá)水平，Western Blot檢測(cè)scFv二聚體對(duì)HASMCs的p-Akt、p-mTOR表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:SDS-PAGE、Native-PAGE電泳顯示經(jīng)過(guò)親和層析得到的抗CTGF單鏈抗體二聚體純度在90％以上，ELISA實(shí)驗(yàn)表明抗體能夠與CTGF特異性結(jié)合;C

5、TGF可促進(jìn)入氣管平滑肌細(xì)胞增殖;RT-PCR檢測(cè)顯示，CTGF對(duì)人氣管平滑肌細(xì)胞的mTOR上調(diào)表達(dá)作用能夠被抗CTGF單鏈抗體二聚體所抑制;Western Blot結(jié)果顯示，抗CTGF單鏈抗體二聚體可抑制人氣管平滑肌細(xì)胞Akt及mTOR的磷酸化。
　　結(jié)論:我們制備了純度較高的且能夠與CTGF特異性結(jié)合的抗CTGF單鏈抗體二聚體，這種單鏈抗體二聚體能夠抑制人氣管平滑肌細(xì)胞增殖;推測(cè)這種效應(yīng)的機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/Akt/mTO