應(yīng)用蛋白組學(xué)方法鑒定p16基因上游序列相關(guān)的胃癌核基質(zhì)蛋白.pdf

1、胃癌(gastriccarcinoma，GC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制至今不甚明了。我們以前的工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了胃癌組織較正常胃粘膜上皮組織的核基質(zhì)蛋白(nuclearmatnxproteins，NMPs)有明顯改變，提示某些核基質(zhì)蛋白可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，但究竟是哪些核基質(zhì)蛋白的變化尚不清楚。p16基因是一種重要抑癌基因，它在細(xì)胞周期中起調(diào)節(jié)作用，與其結(jié)合的NMPs可能在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。為此，本研究聯(lián)合運(yùn)用雙向凝

2、膠電泳(two—dimensionalgelelectr0曲oresis，2一DE)技術(shù)、計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix—assistedhserdesorption／ionizationtimeofflyingmassspectrometry，MALDI—TOF—MS)與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)等技術(shù)手段對胃癌細(xì)胞與正常胃粘膜上皮永生化細(xì)胞差異表達(dá)核基質(zhì)蛋白進(jìn)行研究，期望為進(jìn)一步研究胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新線

3、索。 細(xì)胞癌變與細(xì)胞周期失控密切相關(guān)，一個(gè)典型的細(xì)胞周期包括順序嚴(yán)格的4個(gè)周期：G1一S—G2一M。細(xì)胞周期進(jìn)行的關(guān)鍵在于CDKs的活化，而CDKs受細(xì)胞周期素(cyclins)及其抑制蛋白的正負(fù)調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)的8種cyclins中，尤以cyclinD家族對細(xì)胞增殖具有最重要的意義。阻滯cycnnD的表達(dá)使細(xì)胞不能從Gl期一S期，而其過表達(dá)則使G1期縮短。CyclinD包括D1、D2、D3三個(gè)亞型，分別在不同的細(xì)胞系中表達(dá)。Cyc

4、linD1與CDK4／6結(jié)合形成復(fù)合物，能使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因(Rb基因，為一種抑癌基因)的蛋白產(chǎn)物PRb磷酸化，進(jìn)而激活某些轉(zhuǎn)錄活化因子如E2F(異源雙體轉(zhuǎn)錄子)。E2F能啟動(dòng)DNA合成，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。而p16蛋白則為CDK4／6抑制劑，對CDK4／6有高度親和性。在細(xì)胞增殖的調(diào)控中，p16蛋白和cyclinD1競爭與CDK4／6結(jié)合，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，共同完成對細(xì)胞增殖周期的調(diào)控。cyclinD1對細(xì)胞增殖具有重要意義

5、，其過度表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，因而被認(rèn)為是一種癌基因。因此，當(dāng)p16基因發(fā)生改變及表達(dá)異常時(shí)，則有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。資料表明p16基因與胃癌分化、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有顯著的相關(guān)性。檢測胃癌組織p16基因的各種變化及其相關(guān)的蛋白因子，有助于對胃癌生物學(xué)行為的進(jìn)一步了解和對患者預(yù)后的評估。我們通過雙向電泳技術(shù)檢測胃癌中與p16基因結(jié)合的一種蛋白因子文獻(xiàn)未見報(bào)道。 材料和方法 1.核基質(zhì)的提取及電泳

6、應(yīng)用改進(jìn)的高鹽抽提法提取胃癌細(xì)胞系SGC一790l、胃粘膜上皮永生化細(xì)胞系GES—l的NMPs。先用SGC一7901細(xì)胞和GES一1細(xì)胞的NMPs做單向SDS—PAGE；再用這兩種細(xì)胞的NMPs雙向凝膠電泳(two—mmentionalgelelectrophoresis，2一DE)，采用17cmpH3一10IPGs，先是第一向等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)，聚焦、膠條平衡后，開始第二向聚丙稀酰胺凝膠垂直電泳

7、，膠濃度為12％。 2．DNA探針的標(biāo)記 重組質(zhì)粒p16promterluc—pGL2一Basic用Ec01RI和mndⅢ雙酶切，提取890bp片段D№(包含p16基因外顯子lα上游一869bp片段)，采用地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記探針，DNA斑點(diǎn)雜交法檢測探針的靈敏度。 3．雙向電泳的重復(fù)性 不同時(shí)間獲得兩塊考馬斯亮藍(lán)染色的雙向電泳膠，用PDQuest軟件比較它們，檢測二維凝膠電泳結(jié)果的重復(fù)性及比較66KDa

8、區(qū)域蛋白點(diǎn)差別。 4．Southwesternblot 單向電泳SDS一PAGE轉(zhuǎn)膜后，D№探針與電轉(zhuǎn)移的NCM雜交顯色，在66KDa條帶區(qū)域胃癌組織和胃粘膜正常組織NMPs與p16基因上游序列結(jié)合的存在差異性與以前結(jié)果一致。重新獲得這兩種細(xì)胞NMPs的雙向凝膠電泳，切下66KDa條帶區(qū)域的膠電轉(zhuǎn)移，DNA探針與電轉(zhuǎn)移的NCM雜交顯色，用PDQuest軟件分析、比較，得到SGC一7901的特異顯色點(diǎn)。 5．MAL

9、DI—T0卜淞及數(shù)據(jù)庫檢索 切取與NCM上顯色點(diǎn)相對應(yīng)的考染膠上的蛋白點(diǎn)，經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶切，對所得混合物與基質(zhì)溶合進(jìn)行MALDI—TOF—MS處理，獲得跚F數(shù)據(jù)，登陸http：／／prospector．ucsf．edu／ucsfhtml4．O／msfit．htm網(wǎng)站，用MSFit程序在NCBInr．03．21．2∞6數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定蛋白質(zhì)。 結(jié)果 1.蔗糖密度梯度離心后得到的細(xì)胞核用姬姆薩染液染色，光鏡下觀察未

10、見細(xì)胞質(zhì)碎片，胞核輪廓清楚，胞漿洗脫徹底，400倍視野下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞其中無胞漿污染的細(xì)胞核數(shù)目在199以上，細(xì)胞核純度可達(dá)99％。 2．地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針靈敏度達(dá)0．1pg／μ1，符合實(shí)驗(yàn)要求。 3．sGC一7901細(xì)胞和GES—l細(xì)胞的NMPs做單向垂直電泳，轉(zhuǎn)膜，Southwesternblot，66KDa區(qū)域差異顯著，SGC一7901細(xì)胞的NMPs與探針結(jié)合明顯，與我們以前的結(jié)果一致。 4．同一

11、批配制的試劑、水化緩沖液，相同的IEF條件、聚丙烯酰胺濃度，不同時(shí)間對SGC～7901細(xì)胞的NMPs雙向電泳圖像匹配率94％，重復(fù)性好，符合實(shí)驗(yàn)要求。 5．兩種細(xì)胞的NMPs雙向凝膠電泳后66KDa區(qū)域的Southwesternblot，結(jié)果用PDQuest軟件分析，在SGC一7901膜上有兩個(gè)結(jié)合顯色點(diǎn)，編號為：1號、2號。而GES—l未見結(jié)合點(diǎn)。 6．挖取No.1顯色點(diǎn)相對應(yīng)考馬斯亮藍(lán)染色膠上蛋白點(diǎn)做MALDI～TO

12、F—MS，其肽指紋圖譜(peptidemassfingerprints，PMFs)結(jié)果與一種SFPQ(splicingfactorpmline/g1utamine)蛋白有47％的氨基酸序列匹配。 結(jié)論 1.優(yōu)化了NMPs提取方法，使其更適于雙向電泳。優(yōu)化了雙向電泳聚焦條件，聚焦效果穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性好。建立了一套成熟的雙向凝膠圖像分析方法。 2-通過雙向電泳技術(shù)對SGC一790l細(xì)胞和GES—l細(xì)胞的NMPs與p1