水貂綠膿肝菌fliC基因表達(dá)及其對小鼠免疫效力的研究.pdf

1、綠膿桿菌可以引起人和多種動(dòng)物感染發(fā)病，是一種危害人類健康及畜牧業(yè)發(fā)展的重要條件致病菌。一直以來，人們希望能找出預(yù)防和控制該菌感染的有效方法。近年來發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌具有廣譜耐藥性，其對大多數(shù)防腐劑和抗菌藥物表現(xiàn)為天然或獲得性多重耐藥，所致感染可供選擇的有效抗菌藥物越來越少，使臨床治療的難度不斷增加。此外綠膿桿菌血清型眾多，不同血清型菌株其免疫原性不盡相同，給綠膿桿菌疫苗的研制帶來很大困難。有實(shí)驗(yàn)證明f(l)iC基因是所有綠膿桿菌共同具有的基因

2、，其編碼的鞭毛蛋白是重要的表面抗原，具有種屬特異性，且不同血清型之間具有相同的鞭毛蛋白免疫原，能產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。鑒于綠膿桿菌感染的普遍性，以及鞭毛基因的特點(diǎn)，本研究克隆和表達(dá)f(l)iC基因，并結(jié)合小鼠免疫模型分析其免疫原性，探討綠膿桿菌鞭毛蛋白疫苗對于綠膿桿菌感染的保護(hù)作用，對構(gòu)建綠膿桿菌f(l)iC基因工程疫苗和從根本上防止綠膿桿菌的感染具有重要意義。
　　 首先對山東地區(qū)分離的不同來源綠膿桿菌進(jìn)行鞭毛抗原基因分型，以確定

3、貂源綠膿桿菌的主要流行血清型。分析比較GenBank登錄的綠膿桿菌f(l)iC基因序列，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)分型引物，以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增f(l)iC基因的部分片段，根據(jù)片段大小確定鞭毛類型（A型或B型），對兩種類型代表株的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，驗(yàn)證PCR分型方法的可靠性，最終得出山東地區(qū)貂源綠膿桿菌的流行血清型為H抗原基因A型。
　　 其次對兩種類型代表株f(l)iC全基因進(jìn)行克隆與序列分析。根據(jù)Genbank登錄

4、的A型和B型f(l)iC基因序列分別設(shè)計(jì)引物，在引物的上下游分別引入酶切住點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ，擴(kuò)增兩種鞭毛類型代表株P(guān)ASD01和PASD03的f(l)iC(A型fliC1185bp、B型fliC1467bp)全基因，按常規(guī)方法克隆到pMD18-T載體，制備重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中，用藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)初步篩選可疑陽性克隆?？梢申栃钥寺∵M(jìn)一步進(jìn)行特異PCR和酶切鑒定后對插入片段進(jìn)行測序，并將測序的序列與已知序列進(jìn)行同源性比較。<

5、br>　　 最后對A型鞭毛菌f(l)iC基因進(jìn)行原核表達(dá)，并初步分析其免疫原性及免疫保護(hù)性。將測序鑒定正確的A型f(l)iC基因從pMD18-T-fliCA陽性克隆中純化、回收，與表達(dá)載體pGEX-6P-1連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，得到基因工程菌，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的陽性克隆命名為pGEX-6P-1-f(l)iCA。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE與Western