Cs-ACS1轉(zhuǎn)基因?qū)S瓜性型分化的影響.pdf

1、選育全雌或強(qiáng)雌性黃瓜品種是黃瓜育種主要工作目標(biāo)之一。黃瓜雌花節(jié)位出現(xiàn)早、數(shù)量多、分布均，是黃瓜早熟、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ)。目前，已明確黃瓜的性別分化除受主控基因影響外，還受多種因素制約，其中內(nèi)源乙烯是重要影響因素之一。許多研究者認(rèn)為黃瓜ACC合成酶基因與控制雌性的F位點(diǎn)緊密連鎖。其中，Cs-ACS1基因與F基因同源性極高，早期被誤認(rèn)為就是F基因。可見，黃瓜Cs-ACS1基因與黃瓜雌性分化存在相關(guān)性。為了驗(yàn)證Cs-ACS1基因?qū)D(zhuǎn)基因黃瓜性型

2、分化的影響，本試驗(yàn)采用PCR方法，從全雌系黃瓜0401基因組DNA中擴(kuò)增出2333 bp的基因片段，構(gòu)建成正義、反義基因表達(dá)載體以及由該基因啟動(dòng)子控制紅色熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)載體，并將上述三種植物表達(dá)載體的目的基因?qū)朦S瓜，通過對轉(zhuǎn)基因植株的觀察、分析，證實(shí)Cs-ACS1基因與黃瓜雌性性別分化密切相關(guān)。本試驗(yàn)主要研究內(nèi)容及研究結(jié)果如下：
　　 1.克隆了Cs-ACS1基因
　　 克隆得到Cs-ACS1基因，經(jīng)BLAST

3、分析結(jié)果表明：所克隆的基因序列與公布的Cs-ACS1僅有1個(gè)堿基的差異，核苷酸序列同源性為98％，而推導(dǎo)編碼的247個(gè)氨基酸完全一致。上述結(jié)果表明：所克隆的基因?yàn)镃s-ACS1基因。
　　 2.Cs-ACS1正義基因?qū)朦S瓜后發(fā)生共抑制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因黃瓜植株雄性化
　　 將Cs-ACS1基因插入載體pVCT2102中，構(gòu)建該基因的正義植物表達(dá)載體pVCT2214。經(jīng)酶切及PCR檢測后，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Cs-ACS1正義基

4、因?qū)霃?qiáng)雌系黃瓜0837(本實(shí)驗(yàn)室繁育品種)中。移栽后共獲得12株成活轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，PCR檢測初步確定Cs-ACS1正義基因已轉(zhuǎn)入黃瓜基因組中；通過對成活植株的表型觀察，發(fā)現(xiàn)12株轉(zhuǎn)基因黃瓜植株有10株全部開雄花，而且全部植株的頂芽也為雄花，表明Cs-ACS1基因與強(qiáng)雌黃瓜體內(nèi)的Cs-ACS1基因相互抑制，限制自身Cs-ACS1基因表達(dá)，同時(shí)也限制轉(zhuǎn)入Cs-ACS1基因表達(dá)，即出現(xiàn)共抑制現(xiàn)象。
　　 3.Cs-ACS1反義基因

5、能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因黃瓜植株雄性化
　　 正義植物表達(dá)載體pVCT2214經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切后，獲得反義植物表達(dá)載體pVCT2215。經(jīng)檢測，確定該載體構(gòu)建成功后，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Cs-ACS1反義基因轉(zhuǎn)入強(qiáng)雌系黃瓜0837中。移栽后，該轉(zhuǎn)基因黃瓜共成活2株，對成活的轉(zhuǎn)基因黃瓜檢測(PCR)，確定Cs-ACS1反義基因已轉(zhuǎn)入黃瓜基因組中；觀察成活2株反義轉(zhuǎn)基因黃瓜，發(fā)現(xiàn)植株全部開雄花，而且全部植株的頂芽也為雄花，推測發(fā)生反義抑制的作用。

6、
　　 4.Cs-ACS1-REF基因可在轉(zhuǎn)基因黃瓜的花芽中表達(dá)
　　 將Cs-ACS1基因插入含紅色熒光蛋白的載體中，得到植物表達(dá)載體pVCT2217。用農(nóng)桿菌EHA105/pVCT2217菌液侵染黃瓜(強(qiáng)雌系0837)子葉，經(jīng)培養(yǎng)獲得成活的轉(zhuǎn)Cs-ACS1-REF基因的黃瓜植株6株，全部開雄花。取轉(zhuǎn)Cs-ACS1-REF基因黃瓜基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，確定轉(zhuǎn)CsACS1-REF基因已轉(zhuǎn)入黃瓜基因組中。進(jìn)行一周白化