人胰島素基因改造及其山羊乳腺特異性表達載體構建.pdf

1、為了構建一個高效的經改造后的人胰島素基因乳腺特異性表達載體，從而為利用動物乳腺生產人成熟胰島素打下基礎，我們利用Long PCR技術克隆了長為5151 bp的山羊β酪蛋白基因5P＇調控區(qū)，并且在克隆出改造后的人胰島素基因的基礎上，以奶牛β酪蛋白基因調控區(qū)為指導元件，以綠色熒光蛋白(EGFP)為報告基因，構建了人胰島素基因的乳腺特異性表達載體pEBH，為利用動物乳腺生物反應器生產人成熟胰島素的研究打下了堅實的基礎。研究結果如下：

2、1.利用Long PCR技術成功從人基因組中擴增出長度為1696 bp人胰島素基因，又以人胰島素為模板分三段擴增出長度為262 bp的A肽、218 bp的B肽、928 bp的C肽，連接C肽和A肽。其中包含有完整的編碼序列。序列分析表明，片段和GenBank中公布的人胰島素基因DNA序列的同源性為99％，盡管有三處發(fā)生了堿基突變，但不在主要功能區(qū)并沒有改變蛋白的功能。 2.根據(jù)表達載體pEGFP-C1上的多克隆位點以及質粒pBL中

3、的CSN2啟動子序列設計引物，在引物兩端添加酶切位點，采用定向克隆的方法，成功的將HBCA基因與CSN2調控序列融合在一起。 3.采用定向克隆的方法，利用真核表達載體pEGFP-C1構建了含有報告基因的人胰島素乳腺特異性表達載體pEBH。載體含有抗性基因和綠色熒光蛋白(EGFP)基因，且報告基因和目的基因表達為非融合型表達。 4.用脂質體法將表達載體pEBH轉染體外培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞，經G418初步篩選，通過熒光顯微

4、鏡觀察到報告基因的表達。通過PCR檢測，表明HBCA基因序列已存在山羊乳腺上皮細胞染色體中。 5.采用Long PCR法，克隆了山羊CSN2基因長為5151bp的5＇調控區(qū)。經NCBI blasm軟件進行同源性序列分析，結果表明：所克隆的片段與山羊CSN2基因對應區(qū)段的同源性均為99％，證明為山羊β酪蛋白基因的5＇調控區(qū)。利用本試驗克隆的5＇調控區(qū)和本實驗室已有的長為6.6 kb的3＇調控序列，可以構建高效的乳腺特異性表達載體。