R127W突變型HSPB1載體構建、表達及其與NFL蛋白相互作用的分析.pdf

1、背景：腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Toothdisease,CMT)又稱為遺傳性運動感覺神經(jīng)病(Hereditary Motor and Sensory Neuropathv,HMSN)，是一種最常見的遺傳性周圍神經(jīng)疾病，患病率約40/10萬。臨床上以對稱性遠端肌無力和肌肉萎縮、腱反射減弱或消失及遠端感覺減退等為主要特征。根據(jù)神經(jīng)電生理和病理特點，CMT分為兩型，分別為CMT1型（脫髓鞘型）和CMT2型（軸索型）。從分子遺

2、傳角度探討CMT發(fā)病機制成為目前的熱點，2004年，Evgrafov OV等在1個俄羅斯和1個比利時CMT2F大家系中分別發(fā)現(xiàn)了小分子量熱休克蛋白Bl(heatshock protein Bl, HSPB1)基因的R127W和S135F致病突變，從而證實HSPB1基因為CMT2F型的致病基因。2005年Tang等在1個中國漢族CMT2家系中也發(fā)現(xiàn)了HSPB1基因的C379T(R127W)致病突變。HSPB1屬于小分子量熱休克蛋白家族成員

3、，研究發(fā)現(xiàn)其具有分子伴侶功能，可以穩(wěn)定細胞骨架、協(xié)助其正確組裝。NFL（神經(jīng)輕鏈絲）是真核生物體內的一種主要的中間絲結構，是細胞骨架的重要組成部分。當前研究表明NFL及sHSP突變后能使NFL及sHSP（小分子熱休克蛋白）自身聚集形成聚合物。Evgrafov OV等發(fā)現(xiàn)S135F致病突變的HSPB1和野生NFL(wtNFL)之間存在相互作用，但HSPB1突變后形成聚合物的具體情況及R127W致病突變的HSPB1與wtNFL之間是否也存在

4、相互作用尚不清楚。
　　 目的：觀察野生HSPB1(wtHSPB1)及R127WHSPB1形成的胞內聚合物的情況及R127WHSPB1和wtNFL之間是否存在相互作用，為研究CMT2F發(fā)病機制奠定基礎。
　　 方法：首先通過基因重組技術將HSPB1基因的cDNA序列從宮頸癌Hela細胞文庫中擴增，用Overlap法引入HSPB1基因的379C→T(R127W)突變；然后構建pEGFPN1-wtHSPB1及pEGFPN1-

5、R127WHSPB1真核表達載體；最后將成功構建的pEGFPN1-wtHSPB1、pEGFPN1-R127WHSPB1真核表達載體通過瞬間轉染技術轉入Hela細胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察它們在胞內分布特點。同時將wtNFL真核表達載體(PCL-wtNFL)分別與pEGFPN1-wtHSPB1和pEGFPN1-R127WHSPB1共轉染Hela細胞，通過間接免疫熒光共定位技術初步研究R127WHSPB1和wtNFL之間是否相互作用。

6、r>　　 結果：pEGFPN1-wtHSPB1均勻彌散于Hela細胞的細胞漿和胞核內；pEGFPN1-R127WHSPB1則在細胞內發(fā)生斑塊狀聚集，形成以核周分布為主的聚合物。同時發(fā)現(xiàn)pEGFPN1-R127WHSPB1和PCL-wtNFL存在共定位。
　　 結論：HSPB1的R127W致病突變可能影響其正常的分子伴侶功能，導致蛋白折疊、聚集；pEGFPN1-R127WHSPB1與PCL-wtNFL之間存在共定位，間接證明R1