體外誘導(dǎo)人胚胎生殖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目的： 1．探討維甲酸(RA)、參麥、抗壞血酸作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人胚胎生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)體外分化為心肌細(xì)胞的可行性； 2．觀察人胚胎生殖細(xì)胞經(jīng)三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)不同時間后的分化狀態(tài)； 3．尋求能使人胚胎生殖細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的更安全可靠且高效的誘導(dǎo)劑。 方法： 取5-10周流產(chǎn)人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜，進(jìn)行組織塊培養(yǎng)。以源于自身胚胎組織的成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，在培養(yǎng)液中添加白血病抑制因子(LIF)

2、，觀察人EG細(xì)胞生長及集落形成情況。將培養(yǎng)得到的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，差速貼壁1h去除成纖維細(xì)胞(MEF)，細(xì)胞計數(shù)后以1×10 5/ml的初始密度接種于100mm的培養(yǎng)皿進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)液中去除了LIF。培養(yǎng)5天后，小心挑出類胚體(EBs)接種于24孔板中，然后分別添加含不同濃度RA、參麥、抗壞血酸的誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的分化狀態(tài)。取誘導(dǎo)不同時間(1周、2周、3周、4周)后的細(xì)胞做免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞心肌特異

3、轉(zhuǎn)錄因子GAZA-4和心肌肌鈣蛋白T(eTnT)的表達(dá)情況。用統(tǒng)計學(xué)方法計算人EG細(xì)胞經(jīng)三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后的心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，從而找出各種誘導(dǎo)劑的最佳誘導(dǎo)濃度，并比較三種誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效果。 結(jié)果： 經(jīng)RA、參麥、抗壞血酸三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)1周后，EBs周邊長出的細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形；誘導(dǎo)2周，細(xì)胞之間的突起相互連接；誘導(dǎo)3周，細(xì)胞之間的連接更加緊密，可見幾個細(xì)胞連接形成閏盤樣結(jié)構(gòu)；誘導(dǎo)4周，細(xì)胞呈條索狀排列，走向趨于一致。誘導(dǎo)

4、l周后細(xì)胞即出現(xiàn)GAIA-4弱表達(dá)，核呈棕黃色，數(shù)量較少；誘導(dǎo)2周，陽性細(xì)胞數(shù)量增多且顏色加深，核橢圓形，染成棕色；誘導(dǎo)3周GATA-4的表達(dá)達(dá)高峰，核長橢圓形染色為棕褐色；誘導(dǎo)4周，陽性細(xì)胞數(shù)量較3周時減少且顏色變淡。誘導(dǎo)2周cTnT開始有弱表達(dá)，胞漿染成淺棕色；誘導(dǎo)3周，cTnT的表達(dá)增強(qiáng)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)橫紋樣陽性結(jié)構(gòu)，但主要分布于核周區(qū)，染色為棕色；誘導(dǎo)4周，胞漿陽性反應(yīng)產(chǎn)物明顯增強(qiáng)且分布廣泛，染色為棕褐色。對照組GATA-4和cTn

5、T陰性表達(dá)。RA誘導(dǎo)人EG細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的最佳誘導(dǎo)濃度為10-8mol/l或10-9mol/l，誘導(dǎo)效率最高達(dá)(81.7±0.41)％;參麥的最佳誘導(dǎo)濃度為1 g/l，誘導(dǎo)效率最高達(dá)(57.0±3.25)％；抗壞血酸的最佳誘導(dǎo)濃度為0.1mg/ml，誘導(dǎo)分化率最高達(dá)(85.2±1.79)％。 結(jié)論： RA、參麥和抗壞血酸三種誘導(dǎo)劑均能誘導(dǎo)人EG細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞GATA-4和cTnT陽性表達(dá)?？箟难岷?/p>