拓?fù)涮婵祵?duì)HPB-AM細(xì)胞增殖及MAGE基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、背景：黑色素瘤抗原(Melanoma antigen-encoding，MAGE)是第一個(gè)從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)性抗原(tumor-associated antigen，TAA)。人類(lèi)MAGE基因家族編碼的腫瘤排斥抗原(tumor rejection antigen，TRA)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)加工產(chǎn)生抗原肽，并與HLA-I類(lèi)分子結(jié)合形成復(fù)合物，能誘導(dǎo)自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)特異

2、性識(shí)別，誘導(dǎo)其對(duì)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。MAGE基因在許多惡性腫瘤中都有較高的表達(dá)，而在正常組織(除胎盤(pán)滋養(yǎng)層及睪丸精原細(xì)胞之外)、炎癥組織及良性腫瘤組織中均無(wú)表達(dá)，因而被認(rèn)為是腫瘤特異性的，可用于腫瘤的分子學(xué)診斷和免疫治療。初步的臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了該MAGE基因在抗腫瘤治療中的意義。 拓?fù)涮婵?Topotecan，TPT)是細(xì)胞核拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的獨(dú)特而有效的抑制劑，它通過(guò)與DNA/拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ聚合物形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物來(lái)發(fā)揮其抗

3、腫瘤作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)它對(duì)多種難治性實(shí)體腫瘤尤其對(duì)部分血液系統(tǒng)腫瘤有效，單用 topotecan治療復(fù)發(fā)、難治非霍杰金淋巴瘤有效率達(dá)40％。雖然TPT在治療白血病、淋巴瘤等惡性血液病的臨床實(shí)驗(yàn)中已顯示了明顯的抗腫瘤活性，但對(duì)其作用的分子機(jī)理尚不清楚。TPT對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的作用及其與MAGE基因之間的關(guān)系有待探討。本實(shí)驗(yàn)旨在研究TPT誘導(dǎo)T細(xì)胞淋巴瘤系HPB-AM細(xì)胞株凋亡的作用及TPT作用與MAGE基因之間的關(guān)系，為進(jìn)一步了解TPT對(duì)腫瘤細(xì)胞

4、的作用機(jī)制，提高TPT的臨床療效提供有意義的實(shí)驗(yàn)資料。 方法： 1．本研究以T細(xì)胞淋巴瘤系HPB-AM細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法在mRNA水平檢測(cè)MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4基因的表達(dá)情況。 2．采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT法)檢測(cè)不同濃度(Oμ

5、mol/L，0.05μmol/L，0.10μmol/L，0.15μmol/L，0.20μmol/L)TPT作用于HPB-AM細(xì)胞株不同時(shí)間后(0、4、8、12、16小時(shí))的增殖情況，計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率，并確定TPT抑制HPB-AM細(xì)胞增殖的最小有效濃度和最短作用時(shí)間。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。 3．采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平檢測(cè)TPT對(duì)HPB-AM細(xì)胞株MAGE基因表達(dá)的影響。 4．應(yīng)

6、用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。重復(fù)5次獨(dú)立試驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)以P值<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1．HPB-AM細(xì)胞MAGE基因的表達(dá) MAGE.3的表達(dá)水平為0.94±0.03，MAGE-4的表達(dá)水平為0.85±0.01，MAGE-1、MAGE-2均無(wú)表達(dá)。 2．TPT對(duì)HPB

7、-AM細(xì)胞株增殖的抑制作用 ①采用MTT比色法檢測(cè)結(jié)果：不同濃度(0μmol/L，0.05μmol/L，0.10μmol/L，0.15μmol/L，0.20μmol/L)TPT作用HPB-AM細(xì)胞不同時(shí)間(4、8、12、16小時(shí))，其對(duì)HPB-AM細(xì)胞的抑制作用隨濃度的增高而逐漸增強(qiáng)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。最小有效濃度為0.10μmol/L，濃度為0.15μmol/L時(shí)抑制作用明顯，達(dá)到0.20μmol/L時(shí)抑制作用不再增加；

8、最短作用時(shí)間為8小時(shí)，12小時(shí)抑制作用明顯增強(qiáng)，超過(guò)16小時(shí)抑制作用不再增加。空白對(duì)照組抑制率無(wú)變化。 ②T胛作用細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)改變：濃度0.10μmol/L的TPT作用HPB-AM細(xì)胞12h后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞集落減少，細(xì)胞中顆粒增多，細(xì)胞碎片增多，而TPT作用前細(xì)胞均呈懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚，生長(zhǎng)旺盛。 3．TPT對(duì)HPB-AM細(xì)胞MAGE基因表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示： 當(dāng)TPT濃度為(0μmo

9、l/L，0.05μmol/L，0.10μmol/L，0.15μmol/L，0.20μmol/L)，作用12小時(shí)時(shí)，MAGE-3基因相對(duì)表達(dá)量隨TPT濃度增加而減少，分別為0.94±0.03、0.87±0.05、0.78±0.03、0.65±0.05、0.59±0.06。在濃度為0.10μmol/L時(shí)基因表達(dá)明顯受抑(p=0.0299)。 TPT濃度為0.10μmol/L，作用0、4、8、12、16小時(shí)時(shí)MAGE-3表達(dá)分別為0.

10、94±0.03、0.86±0.04、0.77±0.03、0.65±0.05、0.59±0.03，在作用時(shí)間為8小時(shí)時(shí)基因表達(dá)明顯受抑(p=0.0140)。 當(dāng)TPT濃度為(Oμmol/L，0.05μmol/L，0.10μmol/L，0.15μmol/L，0.20μmol/L)，作用12小時(shí)時(shí)，MAGE-4基因相對(duì)表達(dá)量隨TPT濃度增加而減少，分別為0.86±0.01、0.77±0.04、0.61±0.05、0.50±0.02、0

11、.45±0.03。在濃度為0.10μmol/L時(shí)基因表達(dá)明顯受抑(p=0.0011)。TPT濃度為0.10μmol/L，作用0、4、8、12、16小時(shí)時(shí)MAGE-4表達(dá)分別為0.85±0.04、0.78±0.02、0.67±0.05、0.45±0.02、0.41±0.04，在作用時(shí)間為8小時(shí)時(shí)基因表達(dá)明顯受抑(p=0.0403)。 結(jié)論： 1．HPB-AM細(xì)胞表達(dá)MAGE-3、MAGE-4基因；不表達(dá)MAGE-1、MAG