花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對血管平滑肌細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響.pdf

1、目的 觀察花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表達(dá)血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)以及其與單核細(xì)胞粘附的影響，從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)水平進(jìn)一步探討花刺參粘多糖及其復(fù)方抗動脈粥樣硬化和再狹窄的可能機(jī)制。 方法 組織貼塊法體外原代培養(yǎng)雄性Wistar大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞，取生長穩(wěn)定的3-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞按相同的密度

2、接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，待其生長約90％融合時(shí)，換含0.5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，使細(xì)胞饑餓24h達(dá)到同步化，然后再換含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，取生長良好的VSMC隨機(jī)分為下列各組(每組3個樣本)：空白對照組、TNF-α刺激組(10ng/mL)、TNF-α+花刺參粘多糖組(分別含花刺參粘多糖1.5mg/ml、3.0mg/ml、6.0mg/ml)及TNF-α+復(fù)方花刺參粘多糖組(分別含復(fù)方花刺參粘多糖提取物3mg/ml、

3、6mg/ml、12mg/ml)，空白對照組未加任何干預(yù)因素。繼續(xù)孵育一定時(shí)間后，分別采用流式細(xì)胞術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀察花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α誘導(dǎo)的VSMC粘附分子VCAM-1和ICAM-1蛋白及mRNA水平的表達(dá)，用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)觀察花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α誘導(dǎo)的VSMC與單核細(xì)胞粘附的影響。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果 1.花刺參粘多糖及其復(fù)

4、方制劑對TNF-α誘導(dǎo)的VSMC粘附分子VCAM-1和ICAM-1蛋白水平表達(dá)的影響 (1).花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α誘導(dǎo)VSMC的VCAM-1蛋白水平表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，空白對照組大鼠胸主動脈SMC的VCAM-1呈低水平表達(dá)(平均熒光強(qiáng)度為35.4±2.3)，加入10ng/mLTNF-α孵育24h后，可顯著誘導(dǎo)大鼠SMC高表達(dá)粘附分子VCAM-1(平均熒光強(qiáng)度升為176.4±3.5)，與空白

5、對照組比較P＜0.01?；ù虆⒄扯嗵侨齻€不同濃度組均可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSMC表達(dá)VCAM-1(平均熒光強(qiáng)度分別降為132.1±2.0、99.6±2.5、80.7±1.9)，與TNF-α刺激組比較P＜0.01，且其抑制作用具有濃度依賴性。復(fù)方花刺參粘多糖三個不同劑量組亦均可抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSMC表達(dá)VCAM-1(平均熒光強(qiáng)度分別降為144.0±6.3、105.1±6.4、89.3±3.1)，與TNF-α刺激組比較P＜0.0

6、1，且其抑制作用具有濃度依賴性。 (2).花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α誘導(dǎo)VSMC的ICAM-1蛋白水平表達(dá)的影響 空白對照組大鼠胸主動脈SMC微弱表達(dá)ICAM-1(平均熒光強(qiáng)度為33.9±1.7)，加入10ng/mLTNF-α孵育24h后，可顯著誘導(dǎo)大鼠SMC高表達(dá)粘附分子ICAM-1(平均熒光強(qiáng)度升為92.2±2.9)，與空白對照組比較P＜0.01?；ù虆⒄扯嗵侨齻€不同濃度組均可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSM

7、C表達(dá)ICAM-1(平均熒光強(qiáng)度分別降為71.5±1.6、66.2±1.1、58.3±2.1，)，與TNF-α刺激組比較P＜0.01，且其抑制作用具有濃度依賴性。復(fù)方花刺參粘多糖三個不同劑量組亦均可抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSMC表達(dá)ICAM-1(平均熒光強(qiáng)度分別降為88.1±3.3、72.3±5.6、63.3±2.6)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，且其抑制作用具有濃度依賴性。 2.花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α刺激的

8、VSMC粘附分子VCAM-1和ICAM-1mRNA水平表達(dá)的影響 (1).花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α刺激VSMC的VCAM-1mRNA水平表達(dá)的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組大鼠胸主動脈SMC弱表達(dá)VCAM-1(相對光密度比值為0.30±0.02)，加入10ng/mlTNF-α孵育VSMC12小時(shí)后，VCAM-1mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(相對光密度比值升為0.61±0.03)，與空白對照組比較P＜0.0

9、1?；ù虆⒄扯嗵侨齻€不同濃度組皆對TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1mRNA表達(dá)有明顯抑制作用(相對光密度比值分別降為0.49±0.03、0.46±0.03、0.41±0.04)，與TNF-α刺激組比較P＜0.01，且其抑制作用具有濃度依賴性。復(fù)方花刺參粘多糖三個不同劑量組亦均可抑制TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1mRNA表達(dá)(相對光密度比值分別降為0.53±0.03、0.50±0.04、0.44±0.02)，與TNF-α刺激組比較P＜0.01，

10、且其抑制作用具有濃度依賴性。 (2).花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α刺激VSMC的ICAM-1mRNA水平表達(dá)的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組大鼠胸主動脈SMC弱表達(dá)ICAM-1(相對光密度比值為0.25±0.02)，加入10ng/mlTNF-α孵育12小時(shí)后，ICAM-1mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(相對光密度比值升為0.41±0.03)，與空白對照組比較P＜0.01?；ù虆⒄扯嗵侨齻€不同濃度組均可明顯抑制T

11、NF-α誘導(dǎo)ICAM-1mRNA水平的表達(dá)(相對光密度比值分別降為0.37±0.02、0.35±0.01、0.30±0.03)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，且其抑制作用具有濃度依賴性。小劑量復(fù)方花刺參粘多糖(3mg/ml)對TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1mRNA表達(dá)有減弱趨勢(相對光密度比值為0.39±0.03)，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、大劑量組(6mg/ml、12mg/ml)可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1mRNA表達(dá)(相對

12、光密度比值分別降為0.37±0.02、0.32±0.01)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，隨著劑量的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。 3.花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α刺激的VSMC與單核細(xì)胞粘附的影響 粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對照組中只有少量單核細(xì)胞與VSMC粘附(OD值為0.148±0.032)，在10ng/mlTNF-α孵育24h后，VSMC與單核細(xì)胞粘附作用顯著增強(qiáng)(OD值升為0.467±0.062)，與空白

13、對照組比較P＜0.01。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度的花刺參粘多糖均可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSMC與單核細(xì)胞的粘附能力(OD值分別降為0.383±0.052、0.327±0.029、0.256±0.029)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，且其對細(xì)胞粘附的抑制作用具有濃度依賴性。復(fù)方花刺參粘多糖小劑量組對TNF-α誘導(dǎo)的VSMC與單核細(xì)胞粘附作用有減弱趨勢(OD值為0.427±0.026)，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中、大劑量組均可抑制TNF-α

14、誘導(dǎo)的VSMC與單核細(xì)胞的粘附(OD值分別為0.402±0.016、0.347±0.030)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，隨著其劑量增加，對細(xì)胞粘附的抑制作用增強(qiáng)。 結(jié)論 1.正常情況下，體外培養(yǎng)的大鼠胸主動脈SMC經(jīng)傳代后可有一定量的粘附分子VCAM-1和ICAM-1表達(dá)，但表達(dá)量很低，炎癥因子TNF-α可顯著誘導(dǎo)VSMC表達(dá)VCAM-1和ICAM-1，并明顯促進(jìn)其與單核細(xì)胞的粘附。 2.花刺參粘多糖及

15、其復(fù)方制劑對TNF-α誘導(dǎo)的大鼠胸主動脈SMC粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)具有濃度依賴性抑制作用。 3.花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對TNF-α誘導(dǎo)的VSMC與單核細(xì)胞的粘附能力有明顯抑制作用，且其抑制作用具有濃度依賴性。 4.粘附分子VCAM-1和ICAM-1在介導(dǎo)SMC和單核細(xì)胞的粘附上起著重要作用，花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑抑制單核細(xì)胞和VSMC的粘附與抑制VSMC上VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)具有相關(guān)性