重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)NF-κB-p65shRNA改善mdx小鼠肌肉病變的作用研究.pdf

1、研究目的:
　　研究重組腺相關(guān)病毒攜帶NF-κB/p65 shRNA下調(diào)炎癥通道在mdx小鼠肌肉退行性病變過程中的作用,為“一步法”實(shí)現(xiàn)抗炎和基因替代治療杜興氏肌營養(yǎng)不良綜合癥提供可行的依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.構(gòu)建pAAV-D(+)-U6-NF-κB/p65 shRNA-CMV-ZsGreen質(zhì)粒(以下簡稱為NF-κB/p65 shRNA質(zhì)粒)。采用CsCl梯度離心法提取并純化大量NF-κB/p65 shRNA

2、-ZsGeen質(zhì)粒和pAAV-D(+)-U6-control shRNA-ZsGreen質(zhì)粒(以下簡稱為control shRNA質(zhì)粒)。采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法制備AAV9-D(+)-U6-NF-κB/p65 shRNA-ZsGreen病毒(以下簡稱NF-κB/p65 shRNA病毒)和AAV9-D(+)-U6-control shRNA-ZsGreen病毒(以下簡稱control shRNA病毒),并純化、測定病毒滴度。
　　2.

3、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將NF-κB/p65 shRNA質(zhì)粒和control shRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞(RAW細(xì)胞株),設(shè)立PBS對照組。48小時(shí)候在熒光顯微鏡下ZsGreen藍(lán)色熒光蛋白的表達(dá),以觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和表達(dá)情況。收集細(xì)胞,Western blot檢測各個(gè)組磷酸化 NF-κB/p65蛋白水平的差異。
　　3.將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按鼠齡分為年輕組(1個(gè)月)和年老組(4個(gè)月)。每個(gè)鼠齡按動(dòng)物品種和干預(yù)條件又分為正常組(C57BL/6J小鼠

4、,n=4)、實(shí)驗(yàn)組(mdx小鼠+ NF-κB/p65 shRNA病毒,n=4)、實(shí)驗(yàn)對照組(mdx小鼠+control shRNA病毒,n=4)、實(shí)驗(yàn)空白組(mdx小鼠+PBS,n=4)。除正常組小鼠只接受50μl PBS注射之外,其余組別小鼠的右小腿腓腸肌接受50μl一定滴度的病毒注射,左小腿腓腸肌同時(shí)接受50μl PBS溶液注射。1個(gè)月后,小鼠在CO2箱被處死。所有小鼠左、右腓腸肌被取材并行冰凍切片。直接熒光顯微鏡觀察病毒在各個(gè)組小

5、鼠體內(nèi)表達(dá)差異以及肌肉細(xì)胞膜穩(wěn)定性差異qPCR和免疫組化染色檢測各個(gè)組小鼠肌肉磷酸化NF-κB/p65水平。HE染色比較各個(gè)組小鼠肌肉形態(tài)學(xué)變化并比較中央型細(xì)胞核的肌纖維比例。Masson Trichrome染色比較各個(gè)組肌肉纖維化情況,免疫組化染色mIgG和eMyHC蛋白來比較小鼠肌肉壞死和肌纖維再生在各個(gè)組的差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建NF-κB/p65 shRNA質(zhì)粒并制備相應(yīng)的高純度的血清9型腺相關(guān)病毒。

6、
　　2.Western blot檢驗(yàn)結(jié)果表明NF-κB/p65 shRNA能在炎癥刺激狀態(tài)下降低小鼠巨噬細(xì)胞磷酸化NF-κB/p65的蛋白水平,減輕炎癥程度。
　　3.(1)HE染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠肌肉形態(tài)學(xué)改善,肌肉的炎性細(xì)胞更少,形態(tài)學(xué)表現(xiàn)更接近于正常組。而實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)空白組有大量的炎性細(xì)胞聚集、筋膜增厚、肌肉壞死和脂肪細(xì)胞取代等現(xiàn)象。
　　(2)定量統(tǒng)計(jì)中央型細(xì)胞核肌纖維數(shù)目并進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在年輕組中

7、,實(shí)驗(yàn)組小鼠中央型細(xì)胞核肌纖維數(shù)目低于實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)空白組,說明 NF-κB/p65 shRNA能減少mdx小鼠肌肉退變,延緩其病變過程。但在年老組該數(shù)據(jù)不同組間無明顯差異。
　　(3)qPCR結(jié)果表明,和實(shí)驗(yàn)對照組相比,實(shí)驗(yàn)組的磷酸化NF-κB/p65 mRNA水平顯著性下降。免疫組化結(jié)果證實(shí)磷酸化p65陽性的肌纖維數(shù)量顯著性減少,體內(nèi)炎癥水平明顯減輕。
　　(4)小鼠IgG免疫組化染色結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)組小鼠肌肉壞死情況明顯

8、改善,優(yōu)于實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)空白組。這一差異在年輕小鼠組尤為明顯。
　　(5)胚胎肌重鏈蛋白eMyHC免疫組化染色結(jié)果表明NF-κB/p65 shRNA能減少年輕組mdx小鼠肌肉的再生,延緩其肌肉干細(xì)胞的消耗進(jìn)度,從而提高年老組mdx小鼠肌纖維再生能力。
　　(6)實(shí)驗(yàn)組mdx小鼠肌纖維Evans Blue染料滲透的面積小于實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)空白組,證實(shí)NF-κB/p65 shRNA能提高mdx小鼠肌肉細(xì)胞膜的完整性。